【摘 要】
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拟南芥过敏性诱导反应蛋白(hypersensitive induced reaction proteins,AtHIRs)是植物中特有的具有SPFH(stomatin/prohibitin/flotillin/Hflk/C)结构域的蛋白,与膜筏的形成密切相关并在植物免疫过程中发挥重要功能。本研究通过激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope,LSCM
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拟南芥过敏性诱导反应蛋白(hypersensitive induced reaction proteins,AtHIRs)是植物中特有的具有SPFH(stomatin/prohibitin/flotillin/Hflk/C)结构域的蛋白,与膜筏的形成密切相关并在植物免疫过程中发挥重要功能。本研究通过激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope,LSCM)和可变角度全内反射荧光显微镜(variable-angle total internal reflection fluorescence microscope,VA-TIRFM)对拟南芥AtHIR3蛋白进行研究,发现AtHIR3-EGFP在拟南芥幼苗的不同组织中均有表达,并主要定位于液泡膜,进一步观察发现AtHIR3-EGFP在液泡膜上的分布不均匀。AtHIR3-EGFP在液泡膜上的运动方式包括布朗运动、受限运动、定向运动和混合运动。蛋白质谱分析发现,V-ATPase(液泡膜H+-ATPase)复合体的VHA-A亚基与AtHIR-EGFP处于同一复合体。运用双分子荧光互补(BiFC)和酵母双杂交实验进一步证明,AtHIR3和AtVHA-A蛋白存在相互作用。共聚焦显微镜观察发现AtHIR3与AtVHA-A共定位于拟南芥的液泡膜上。在Athir3突变体中,AtVHA-A-EGFP的扩散系数、运动范围和荧光漂白后恢复速率均大于野生型。此外,Athir3拟南芥幼苗根表皮细胞液泡的pH值略有升高,在NaCl处理1h后,Athir3突变体中液泡pH值升高的幅度高于野生型。进一步分析NaCl对AtHIR3-EGFP在液泡膜上运动的影响,发现NaCl使其扩散系数降低,运动范围减小。综上,AtHIR3蛋白主要位于拟南芥液泡膜,并与V-ATPase的VHA-A亚基相互作用,限制了 VHA-A蛋白在液泡膜上的运动。这些结果表明,AtHIR3蛋白可能通过招募VHA-A蛋白到液泡膜膜筏微区,促进V-ATPase将H+转运到液泡内的过程,相关结果为阐明V-ATPase的H+转运调控机制提供了新观点。
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