遗传性泛发性色素异常病(Dyschromatosis universalis hereditaria，DUH)是一种少见的遗传性皮肤病，其特点是色素沉着和色素缺失形成网状或花斑状斑块。色素沉着异常以全身性的形式分布，躯干和四肢是色素沉着和色素缺失是最明显的部位，这些皮损可以扩散到脸、手和脚，甚至头发，牙齿和指甲也出现异常的色素沉着。大多数DUH病人在这些区域表现出弥漫的色素沉着，掺和斑状的色素缺失。　　自从1933年Ichikawa and Hiraga首先报道了两代都患有DUH的两个家系之后，历时半个多世纪，关于该病的致病基因和发病机制一直未能找到和阐述清楚。　　我们用定位克隆的策略分析了两个中国DUH家系和一个美国DUH家系，均在SASH1(SAM and SH3 domain containingⅠ)基因中检测到了与异常表型共分离的突变位点，它们分别是家系Ⅰ的第13个外显子的2000位核苷酸发生G→A的颠换;家系Ⅱ的第13个外显子的2019位核苷酸发生T→C的颠换;家系Ⅲ的SASH1基因的第14个外显子的2126位核苷酸发生T→G的置换。这三个核苷酸的改变引起SASH1非保守性的，错义突变，导致509位密码子甘氨酸→赖氨酸的替换(命名为E509K)，515位密码子亮氨酸→脯氨酸的替换（命名为L515P），551位密码子酪氨酸→天冬氨酸的替换(命名为Y551D)。同时在500个正常人群对照和包括HapMap在内的所有数据库中也没发现这种改变，因此这些突变很可能是致病基因的突变位点。　　目前关于DUH基因的功能仍不是十分清楚，为了进行SASH1基因的功能学研究和阐述遗传性泛发性色素异常病的发病机制，我们首先从胎儿cDNA文库中获得野生型SASH1基因的编码区序列(CDS序列)，采用定点突变的方法构建三种突变型的SASH1基因序列。我们通过构建带有Flag和抗生蛋白链菌素结合蛋白(streptavidin binding protein(SBP))标签序列的野生型和三个突变型pBABE-SASH1重组逆转病毒载体，并将pBABE-SASH1重组逆转病毒感染黑色素瘤A375细胞，使pBABE-SASH1重组逆转病毒在黑色素瘤A375细胞中稳定表达。我们对连接有三个突变型和一个野生型的SASH1基因序列的载体分别进行命名:将509位编码子(GAA→AAA，E509K)的突变命名为Mutation l(M1)或SASHlE509K，将515位编码子(CTC→CCC，L515P)的突变命名为Mutation2(M2)或SASHlL515P，将551位编码子(TAC→GAC，Y551D)的突变命名为Mutation3(M3)或SASH1Y551D，而将野生型的SASH1基因命名为Mutation0(M0)或WT SASH1。表达野生型Pbabe-SASHl重组载体的A375细胞，我们命名为BM0-A375或SASHlWT-375细胞，而将表达三个突变型pBABE-SASH1重组载体的A375细胞分另别命名为BMl-A375或SASHlE509K-A375，BM2-A375或SASH1L515P-A375，BM3-A375或SASHl Y551D-A375细胞。同时我们将表达pBABE空病毒载体的细胞和不转染pBABE载体的A375细胞分别命名为BF-A375或VECTOR-A375和A375或BLANK-A375细胞。　　在前期研究的基础上，我们从多个方面开展了遗传性泛发性色素异常病致病基因的功能学研究，以期揭示遗传性泛发性色素异常病致病基因的发病机制。我们的研究结果显示:　　1.表达SASHlY55lD突变的病人上皮组织黑色素合成的增加和黑色素分布的不均一。　　在SASHlY551D突变的家系Ⅰ的其中一个DUH病人上皮组织的基底层、棘层、颗粒层甚至角质层，可以观察到明显的黑色素分布不均一和黑色素含量的增加。在基底层中，浓而深染的黑色素不仅以“帽子装结构”位于黑色素细胞的顶部，在黑色素细胞的底部也有浓而深染的黑色素分布。同时，在棘层、颗粒层和角质层黑色素细胞的顶部和底物也能观察到明显的黑色素分布。黑色素细胞特异性标记物Pmel17的免疫组化结果也提示黑色素细胞从基底层向角质层发生迁移。这些结果表明黑色素细胞从基底层向角质层方向发生了转移。令人奇怪的是，在同一张切片上既有出现色素增生(hyperpigmentation)的区域，也有色素缺失(hypopigmentation)的区域。与此相反，正常对照上皮组织的黑色素主要分布在黑色素细胞的顶部，很少分布在黑色素细胞的底部。同一张切片不同区域的上皮组织中黑色素细胞内黑色素的分布均匀。此外，还可以观察到增厚的基底层以上的上皮层和形态变形的黑色素细胞。我们用黑色素细胞的特异性标记物Pmel17对黑色素细胞进行数量定量，结果显示有的区域出现明显的黑色素细胞增多，而有的区域出现明显的黑色素细胞减少。总的黑色素细胞的数量和正常相比并没有明显变化。所有这些结果提示DUH是一种上皮黑色素合成单元内黑色素细胞分布不均的异常疾病。　　2.SASH1基因的突变能够体外引起黑色素细胞移动性的增强，　　根据DUH病人上皮组织中SASHlY551D突变能够引起黑色素细胞从基底层向基底层、棘层、颗粒层甚至角质层向上迁移的重要研究提示，我们在体外验证了三个突变型的SASH1能够引起黑色素细胞移动性的增加。我们的transwell迁移实验和transwell侵袭实验研究表明，BM1-，BM2-和BM3-A375细胞中迁移的细胞数量明显多于A375，BF-和BM0-A375细胞。类似地，BM2-和BM3-A375细胞的侵袭数量也明显多于BM0-A375，表明SASH1基因突变能够引起的黑色素细胞移动性的增强。有趣的是，与A375和BF-A375细胞相比，野生型SASH1在黑色素瘤细胞中的过表达能够促进黑色素瘤细胞的侵袭性，提示SASH1基因能够激活黑色素瘤细胞发生转移。　　3.SASH1蛋白的亚细胞定位位于细胞浆边缘靠近细胞膜的部位;SASH1基因的突变能够引起SASH1的表达激活。　　我们通过构建表达野生型和三个突变型pBABE-SASH1的稳转A375细胞株，激光共聚焦显微镜研究结果显示，野生型SASH1-FIag融合蛋白定位于细胞浆边缘靠近细胞膜的部位，并在细胞浆边缘出现局部高表达现象，特别是在将要发生细胞与细胞融合的区域最为明显，而当两个或多个细胞发生融合以后，SASH1-Flag融合蛋白在细胞浆边缘局部高表达的现象消失，这一现象提示野生型的SASH1可能参与黑色素瘤细胞的迁移或侵袭和转移。而突变型SASH1-Flag融合蛋白在细胞浆边缘局部高表达的现象没有野生型明显。　　突变型的SASH1基因在黑色素细胞中稳定表达能够引起SASH1的表达上调。Real time RT-PCR和wester blot显示三种突变型的SASH1在黑色素瘤细胞中的表达明显高于野生型。来自于家系Ⅰ的DUH患者上皮组织的免疫组化结果显示，SASH1不仅在基底层黑色素细胞高表达，而且在棘层、颗粒层和角质层黑色素细胞中也出现高表达，同时存在上皮组织中表达的不均一性。　　4.SASH1的突变能够引起早期黑色素小体和成熟期黑色素小体基质蛋白的表达激活。　　Real time RT-PCR和western blot结果均显示SASH1的突变能够引起黑色素细胞早期黑色素小体和成熟期黑色素小体基质蛋白Pmel17和TYRP1的表达上调，免疫荧光结果表明， SASH1基因在黑色素瘤细胞中的过表达能够引起Pmel17和TYRP1蛋白水平的表达增加。Pmel17和TYRP1在BM0-A375和BM1-A375，BM2-A375，BM3-A375细胞之间存在表达差异，同时BM0-A375细胞Pmel17的表达水平明显高于BF-A375细胞的表达水平。当用特异性SASH1的dsRNA下调SASH1基因的表达后，则可减弱Pmel17和TYRP1表达的上调。　　Western blotting显示，和VECTOR-A375，BLANK-A375和BM0-A375细胞相比，BM2-A375和BM3-A375细胞中TYRP1的表达升高。除了各组A375细胞都存在明显的75Kda的TYRP1条带外，而在BM0-A375，BM1-A375，BM2-A375和BM3-A375细胞还存在明显的120Kda条带。而且与A375和BF-A375相比，120Kda处的TYRP1在BM0-A375，BM1-A375，BM2-A375和BM3-A375细胞中存在差异表达。SASH1基因的沉默能够使不同组A375细胞的TYRP1的表达下调，同时使存在于BM2-A375，BM3-A375与A375，BF-A375，BM0-A375之间的TYRP1的差异表达消失。　　5.SASH1的突变激活黑色素小体转运蛋白Rab27a的表达。　　同样地，Real time RT-PCR和western blot结果表明，与BM0-A375细胞的Rab27a相比，SASH1突变能增强BM2-A375和BM3-A375细胞Rab27a的表达，Rab27a在BM2-A375、BM3-A375细胞与BM0-A375细胞之间存在差异表达。SASH1沉默能下调BM1-A375和BM3-A375细胞中Rab27a;与BM0-A375和BM2-A375细胞相比，BM1-A375和BM3-A375细胞中Rab27a出现明显的表达下调。SASH1沉默也能消除存在于BM1-A375，BM3-A375细胞和BM0-A375细胞之间的Rab27a的差异表达。　　此外，与BF-A375细胞相比，免疫荧光分析显示野生型和突变型SASH1基因在BM0-，BM1-，BM2-和BM3-A375细胞的过表达能够诱导Rab27a表达的增强。BM0-A375，BM1-A375，特别是BM2-A375和BM3-A375能够增加Rab27a在细胞浆周边呈闪点状的分布和表达增强。相似地，免疫组化分析显示，家系Ⅰ的DUH病人的上皮组织表现出Rab27a的明显表达增强和表达的不均一性。　　6.Pull down实验和Nano-flow LC-MS/MS质谱分析提示SASH1参与黑色素代谢。　　BM0-A375细胞的pull down和Nano-flow LC-MS/MS分析显示，SASH1能够与参与黑色素生成有关的几个重要蛋白（MAP4K4，MAPKK2和CALM）发生相互作用。BM0-A375细胞和稳定转染野生型SASH1基因的乳腺癌细胞株MDA-MB-231的质谱分析也提示，SASH1能够与参与粘附连接、细胞生长和分化的几个重要蛋白IQGAP1、CALM和MAP2K2发生相互作用。位于MAPK信号通路的MAPKK2(MEK2)在黑色素细胞中参与了黑色素代谢的调控，MAP4K4能够通过MEKK1激活MAPKK2。此外，SASH1能够直接和CALM相互作用调节黑色素合成。生物信息学PANTHER功能学分类提示，我们质谱分析鉴定的一些蛋白参与细胞粘附、代谢过程和酶调节因子的活性。重要的是，根据PANTHER信号通路的功能学分类结果，几个鉴定的蛋白是与黑色素生成相关的Ras信号通路，EGF受体信号通路，MAPK信号级联和内皮素信号通路的成员。因此，我们推测，SASH1可能通过MAPK和/或内皮素信号通路参与黑色素生成和黑色素合成。