细胞色素P450酶(cytochromeP450，CYP)是一组由许多同工酶组成的超基因大家族，对许多内源、外源性化合物在体内的Ⅰ相生物转化有重要作用。大部分药物都经肝脏CYP450酶代谢，CYP450酶代谢药物使其失活，也能使某些无活性的药物转化成活性物质而产生药理作用或毒性。药物也能影响CYP450酶在肝脏的表达，诱导或抑制CYP450酶的活性。临床上2种或多于2种药物在同时或前后序贯用药时，引起药物相互作用，干扰代谢环节，使疗效增强或减弱，最常见的原因是CYP450的诱导和抑制。药物代谢相互作用中，酶抑制引起的药物相互作用约占全部相互作用的70％，酶诱导引起的相互作用约占23％，其他则占7％。某种P450亚型抑制将降低被该亚型代谢的药物的消除，使其半衰期延长，血药浓度增加，延长药理作用时间，并增加药物的不良反应。因此，研究CYP450抑制与药物之间的关系，确定参与代谢的CYP类型，不仅可预测有问题的CYP抑制作用，从分子水平说明药物问的相互作用及其毒性，而且可利用某些药物对CYP同工酶的选择性抑制或诱导作用，合理地调控CYP同工酶活性，预防或减轻药物间的相互作用，最大限度的提高药物的有效性和安全性。 目前研究CYP450抑制的方法主要有单克隆抗体技术、化学性的抑制剂、反义寡核苷酸、基因敲除等方法。化学抑制剂探讨和确定参与该外源化合物代谢的CYP类型起了重要作用，因其便宜，使用简单方便，应用较广。然而大部分化学抑制剂特异性差，某些抑制剂选择性的全面信息尚不清楚，如酮康唑不仅抑制CYP3A4而且还对CYP1A2、CYP2D6、CYP2C8有抑制作用；单克隆抗体己经用于细胞色素CYP450各种功能性研究，确定参与催化活性的CYP类型，也能通过免疫印迹来研究蛋白定性和定量，是目前研究CYP450抑制最可靠的方法。然而抗体来源困难而且价格昂贵，制备需纯化，不易用于细胞实验和体内实验，许多商业用抗体鼠来源，不能有效地抑制人的CYP酶活性，CYP3A的抑制性抗体较难区分CYP3A4和CYP3A5两种亚型，使其不能全面反应药物与代谢酶之间关系。反义寡核苷酸对药物代谢研究起了一定作用，但研究发现ASON不稳定、不易透过细胞膜且作用弱，限制了它的应用；小鼠cyp基因敲除模型是研究药物代谢的良好模型，主要研究限于毒理及生物利用度方面的研究，因方法研制周期长，费用昂贵，技术上要求非常高等原因，难以在药物代谢研究中推广。 近几年兴起的一个反向遗传学的研究工具RNA干扰技术(RNAinterference，RNAi)，为我们研究基因功能的提供了一项简单而快速的技术，已经在各种细胞系、原代细胞，甚至在小鼠体内抑制了基因表达，进行了功能学的研究。本研究试利用RNAi具有操作简单、快速、高通量、高特异性和高抑制率的技术特点，对CYP3A4酶进行研究，建立有效地抑制CYP3A4基因RNA干扰方法，为今后进行CYP3A4基因的抑制研究奠定基础，为RNA干扰技术运用于CYP同工酶及其它代谢酶抑制研究提供实验依据，为RNAi技术在整体动物CYP同工酶的研究奠定基础。 第一部分.沉默CYP3A4基因的shRNA质粒表达载体的构建目的：RNA干扰(RNAinterference，RNAi)技术是近年广泛应用的新技术，它能明显抑制目的基因的表达。构建三个抑制CYP3A4基因的短发夹状RNA表达质粒(smallhairpinRNA，shRNA)及阴性对照shRNA表达质粒，同时构建抑制绿色荧光蛋白(greenfluorescentpotein，GFP)的短发夹状RNA表达质粒，检测其在转基因CHL-3A4细胞中抑制外源GFP的表达作用，为下一步在转基因CHL-3A4细胞上对CYP3A4基因进行RNAi研究奠定基础。 第二部分.质粒表达型shRNA对CHL-3A4转基因细胞系CYP3A4基因表达的影响目的：研究和探讨质粒表达型shRNA对CHL-3A4转基因细胞CYP3A4基因表达的抑制作用，建立有效地抑制CYP3A4基因RNA干扰方法，为进一步在原代培养人肝细胞上研究CYP3A4基因的功能奠定基础。 第三部分.质粒表达型shRNA对原代培养人肝细胞CYP3A4基因表达的影响 研究质粒表达型shRNA对原代培养人肝细胞CYP3A4及其它CYP亚型CYP1A2、CYP2E1、CYP3A5、CYP2D6基因表达的影响，比较与化学性抑制剂酮康唑对CYP酶的影响，为应用于RNA干扰技术对其它CYP同功酶及其它Ⅱ相代谢酶的研究，甚至动物体内的进行CYP同功酶的研究奠定基础。