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目的:探讨高磷诱导的磷酸钙晶体对人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)成骨转分化的作用,及其胞内信号转导通路。方法:1、高磷培养基(3 mmol/L)于37℃孵育3 d,超速离心法分离磷酸钙晶体和上清液,SEM、EDX分析晶体理化特征。HASMCs分为对照组、高磷组、晶体组和上清液组。茜素红染色、邻甲酚酞络合酮法检测钙化结节、钙含量。Western印迹检测BMP-2、RUNX2和OPN成骨蛋白表达。进一步采用PPi 10μmol/L抑制磷酸钙晶体形成,检测上述成骨蛋白表达。2、磷酸钙晶体刺激HASMCs,western印迹检测p-Smad1蛋白表达。分别用BMP-2抑制剂noggin 1μg/ml、BMP-2 shRNA和Smad1 shRNA预处理阻断BMP-2/Smad通路后,检测HASMCs成骨蛋白表达。3、磷酸钙晶体刺激HASMCs,激光共聚焦检测线粒体ROS。采用线粒体呼吸链抑制剂鱼藤酮10μmol/L处理细胞,观察线粒体ROS、钙化和成骨蛋白表达。磷酸钙晶体刺激HASMCs,western印迹检测p-IKKβ、IκBα和核p65蛋白表达。转染p65 shRNA至HASMCs,观察细胞钙化。采用鱼藤酮10μmol/L处理后,检测p-IKKβ、IκBα和核p65蛋白表达。结果:1、高磷可诱导球形的磷酸钙晶体形成,直径30~500 nm,钙磷比例1.45±0.03。与对照组相比,磷酸钙晶体诱导HASMCs钙化结节形成、钙含量增加及BMP-2、RUNX2和OPN蛋白表达上调(p均<0.05)。PPi可明显抑制磷酸钙晶体诱导的HASMCs BMP-2、RUNX2和OPN蛋白上调(p均<0.05)。2、磷酸钙晶体刺激HASMCs 30 min,p-Smad1蛋白上调并达到高峰。Noggin和转染BMP-2shRNA均可阻断磷酸钙晶体诱导的HASMCs p-Smad1蛋白上调,部分阻断RUNX2和OPN蛋白上调(p均<0.05)。转染Smad1 shRNA可部分阻断磷酸钙晶体诱导的HASMCs RUNX2和OPN蛋白上调(p均<0.05)。3、磷酸钙晶体以时间依赖的方式刺激HASMCs线粒体ROS产生。鱼藤酮可抑制磷酸钙晶体引起的HASMCs线粒体ROS产生,减少HASMCs钙化结节、钙含量,并部分抑制BMP-2、RUNX2和OPN蛋白上调(p均<0.05)。磷酸钙晶体以时间依赖的方式激活HASMCs p-IKKβ蛋白,降解IκBα和促进p65蛋白核转移。转染p65 shRNA可减少磷酸钙晶体诱导的HASMCs钙化结节和钙含量(p<0.05)。鱼藤酮可明显抑制磷酸钙晶体诱导的HASMCs p-IKKβ蛋白上调、IκBα蛋白降解和p65蛋白核转移(p均<0.05)。结论:高磷通过磷酸钙晶体促进HASMCs成骨转分化。磷酸钙晶体通过BMP-2/Smad和线粒体ROS介导的NF-κB信号通路促进HASMCs成骨转分化。