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怀山药（Dioscorea opposita Thunb.）是薯蓣科薯蓣属多年生草质藤本植物,其地下块茎部分药食兼优,但由于长时间的无性繁殖,造成品质退化和产量降低。本研究在前期已克隆怀山药DoSERK2基因并构建其过表达载体的基础上,进一步开展怀山药体细胞胚胎发生与DoSERK2基因遗传转化的研究,对于怀山药的快速繁殖、基因功能的鉴定以及基因工程育种具有重要意义。主要研究结果如下:1.怀山药的体细胞胚胎发生（1）体细胞胚的诱导。毒莠定（Picloram,PIC）是影响怀山药体细胞胚诱导的关键因素,在含不同浓度毒莠定的培养基上带腋芽茎段均可诱导形成体胚,以培养基MS+PIC 5 mg·L-1+CuSO4 2μmol·L-1的诱导效果最佳,8周时体胚诱导率和平均体胚数分别为91.67%和6个。将带腋芽茎段、带节点茎段、叶片三种外植体在最佳体胚诱导培养基上培养,带腋芽茎段的诱导效果最为理想。（2）体细胞胚的增殖与分化。体胚最佳增殖培养基为MS+6-BA 0.5 mg·L-1+Pic 1mg·L-1+CH 0.6 g·L-1+Pro 1 g·L-1,增殖系数达到3.25。光照下体胚表面生成黄色或白色致密愈伤组织,生长一段时间后,变成绿色,将其转接到MS+6-BA 0.4 mg·L-1培养基上培养,6-7周后再生出植株。（3）体细胞胚的鉴定。以醋酸洋红和伊文思蓝进行双染色,证明怀山药茎段腋芽处长出的小球是由胚性组织聚合成的胚状体,随后发育成球形胚、盾形胚和畸形胚,畸形胚不能形成再生植株。对球形胚增殖过程中产生的愈伤组织进行双染色,发现只有致密黄色或白色组织是胚性愈伤组织。2.怀山药DoSERK2基因的遗传转化（1）构建了怀山药DoSERK2基因的沉默载体pART27-SERK。先将干扰片段重组到中间载体pHANNIBAL上,将带有35S启动子和NOS终止子的干扰片段切下插入到载体pART27上,完成沉默载体的构建。（2）怀山药不同外植体的抗生素敏感性不同,潮霉素（Hyg）和卡那霉素（Kan）对怀山药类原球茎的选择压分别为15 mg·L-1和160 mg·L-1;二者对微型块茎的选择压分别为15 mg·L-1和120 mg·L-1;二者对再生苗生根的选择压分别为20 mg·L-1和160 mg·L-1;抑菌剂特美汀（Tim）的浓度确定为500 mg·L-1。（3）初步建立了农杆菌介导的怀山药微型块茎遗传转化体系。含过表达载体pCAMBIA1301-SERK农杆菌OD600为0.5,侵染30 min后,将微型块茎切片转接到含AS 100μmol·L-1的共培养基上培养3 d,然后在含Hyg 15 mg·L-1的再生苗培养基和含Hyg20 mg·L-1生根培养基上筛选,获得生根良好的抗性再生植株,经GUS和PCR检测获得DoSERK2过表达转基因植株。以上述同样方法,将沉默载体pART27-SERK转化微型块茎,微型块茎再生筛选压为Kan 120 mg·L-1和再生苗生根筛选压为Kan 160 mg·L-1,经PCR检测获得DoSERK2沉默转基因植株。（4）建立了农杆菌介导的怀山药瞬时表达体系。以GUS和GFP基因为报告基因,注射的菌液浓度OD600为0.6,共培养3 d时,GUS基因和GFP基因开始有表达,最适观察时间分别为5 d和4 d。