论文部分内容阅读
保幼激素(juvenile hormone,JH)是昆虫一种重要的内激素,该激素的存在及滴度会对昆虫的虫态维持,生殖器官的发育及滞育等产生重要影响。本试验试供昆虫为洋虫(Ulomoidesdermestoides(Chevrolat)),在确定该昆虫的幼虫虫龄数、龄期,蛹的发育历期的基础上,采用液相法检测了主要在鞘翅目中行使JH功能的JH Ⅲ在洋虫体内的滴度变化,并通过基因克隆(RACE)、序列比对以及荧光定量(qRT-PCR方法),研究了JH合成、运输、代谢相关酶基因的序列及在不同阶段的表达特征,结果如下:1.观察了洋虫卵-成虫的各个时期的生物学特性。确定洋虫幼虫共有5个虫龄,个别极端环境下会有第6个虫龄的出现。确定了幼虫龄期和蛹的发育历期。2.通过采用基因克隆及RACE方法,克隆出了洋虫体内JH酸甲基转移酶(JHAMT)、JH绑定蛋白(JHBP)、JH酯酶(JHE)、JH环氧水解酶(JHEH)基因全长,并克隆了 3-羟甲基戊二酰CoA合成酶(HMGS)和3-羟甲基戊二酰CoA还原酶(HMGR)基因的保守序列。得到了UdJHAMT,UdUHBP,UdJHE和UdJHEH的序列全长,及HMGS和HMGR的部分cDNA序列。3.通过Blastn和Blastx比对,确认了上述全部基因克隆出的基因相关保守序列。对获得全长的四种基因UdJHAMT、UdJHBP、UdJHE和UdJHE和通过ORF finder(Open Reading Frame Finder)找出了的阅读框中的可能氨基酸序列结构,进行氨基酸序列预测。并针对这些预测氨基酸序列进行分析:用ProtParam软件计算分子量,等电点;采用GENEDOC进行氨基酸序列多重序列比对;采用CLUSTALW2对获得的序列进行基因系统同源物的分析;通过这些氨基酸序列结构,进行多重序列比对并建立了系统发育树。通过多重序列比较找出了 JHAMT的功能序列;建立基因系统同源物的进化树则发现:洋虫的基因同源性与拟步甲科昆虫赤拟谷盗和黄粉虫基因上最为接近,与鳞翅目昆虫在基因上同源性最远。4.通过qRT-PCR的方法,检测了上述基因在不同虫龄(4、5及6龄)和蛹-成虫时期的mRNA表达特征,发现:(1)UdUAMT为明显与洋虫蜕皮、变态相关的酶类基因。在各虫龄(虫态)开始或即将蜕皮(变态)时UdJHAMT的表达量明显较低。随着幼虫虫龄和体型增大,UdJHAMT的表达也会随之相对加大。UdUHAMT的表达量在洋虫的同一虫龄的不同阶段,或不同虫态之间变化较大;蛹期和成虫期UdJHAMT常出现下调表达的状态,总体水平显著低于幼虫期。(2)JHBP作为JH的运输酶,其基因在洋虫体内转录水平表达趋势是:在每个虫龄(或虫态)开始阶段,相对表达量较低;然后表达量开始上升,并在各龄幼虫(或蛹、成虫)的中期,维持较高的表达水平;在即将蜕皮(或变态)时表达量又下降。值得说明的是洋虫不同虫龄里,每个龄期中的UdJHBP表达变化都不显著:并没有显著的表达上调,也没有过于明显的转录水平的抑制。(3)JHE和JHEH是与JH代谢直接相关的酶类,也直接参与洋虫蜕皮、变态。这两个酶的基因UdJHE和UdJHEH在各龄期(或虫态)开始mRNA的相对表达量相对上调幅度较大;在洋虫即将蜕皮(或变态)关键期的mRNA上调转录水平与各龄期开始时趋势相同,也为表达大幅上调状态,从而降解掉昆虫体内行使功能的JH,进而打破昆虫体内的激素平衡,促使生长蜕皮或变态蜕皮发生。(4)HMGS和HMGR酶基因的qRT-PCR检测中未找到与JH相关的限速证据。这两个基因的mRNA在5龄洋虫体内表达变化趋势不明显。在洋虫即将蜕皮(即化蛹)时也没有明显的表达变化特征。5.通过HLPC的方法进行了洋虫体内JH Ⅲ滴度的检测。色谱条件:流动相:甲醇:水=75:25,进样量10μL,流动相为1 mL/min,紫外检测波长λ=218nm,检测温度t= 25 ℃。该色谱条件下JH Ⅲ出峰时间为12 min。线性回归方程为:y == 23538 x +57.84,R2 = 0.999。其中 a= 23538,b=57.84,R2=0.999。JH Ⅲ的在洋虫体内的滴度变化规律显示:(1)在幼虫-幼虫的蜕皮阶段,JH Ⅲ的滴度含量相对较低,在蜕皮后的洋虫幼虫发育阶段,JH Ⅲ的含量则较高。(2)在幼虫-蛹变态关键期JH Ⅲ在洋虫体内含量极低,蛹的发育阶段JH Ⅲ在洋虫体内滴度有所升高,在蛹-成虫的变态关键期,JH Ⅲ的滴度又降至极低点,并在成虫48h后JH Ⅲ在洋虫体内的滴度又重新开始上升趋势。(3)JH Ⅲ在洋虫体内的滴度与该昆虫发育、蜕皮、化蛹及羽化等不同生理状态直接相关。6.试验中通过对相关酶基因mRNA水平表达的qRT-PCR检测和JH Ⅲ滴度含量HPLC检测的获得的数据进行对比,结果显示:(1)JH Ⅲ在洋虫体内滴度变化与UdJH4MTmRNA的表达变化趋势显示出较高的一致性,即UdJHAMT为洋虫体内JHⅢ的关键合成酶及限速酶基因。(2)各种不同功能酶的基因转录水平表达变化规律对比分析发现:UdJHAMT和UdJHBP的mRNA的相对表达趋势表现出了高度的一致性;UdJHAMT与UdJHE、UdJHEH的表达量上升或下降的趋势基本相反;在正常发育幼虫、蛹和成虫初期阶段UdJHE与UdJHEH的基因表达水平有很高的一致性。在逆境诱导产生的特殊的6龄幼虫期,UdJHEH和UdJHE表现出了一定阶段的相对表达趋势的一致性,同时也体现了在该特殊时期UdJHEH和UdJHE在降解JH过程中的互补性。(3)JH Ⅲ在洋虫体内的滴度变化与UdJHAMT的表达直接相关,并与UdJHE和UdJHEH有一定的相关性。