RecQ解旋酶是一种重要的大分子代谢物质,对维持遗传物质的稳定性起到关键作用。研究发现RecQ解旋酶参与多种代谢过程,如DNA复制、修复、转录重组、核糖体组装、RNA拼接、蛋白翻译,端粒稳定等。虽然目前发现的RecQ解旋酶种类越来越多,但这类酶在其氨基酸序列上是具有一定的保守性,可选用具有典型功能结构域的模式生物RecQ酶作为研究对象,对其蛋白结构与功能开展研究工作。本文以枯草杆菌(Bacillus subtilis) RecQ解旋酶为研究对象,研究其RecQ的蛋白结构与酶生化活性的相互关系,以揭示RecQ解旋酶的分子运作机制。本实验室前期工作发现枯草杆菌具有两种天然异构体(本文命名为B.subtilis RecQ L和B.subtilis RecQ S):一个含HRDC区域,另一个则缺失。因此可利用这种特性来进行研究。本实验以Bacillus subtilis168中抽提的基因组DNA和质粒B.subtilis RecQ L-pET15b为模板,PCR扩增分别得到大小为1.5kb和1.8kb的B.subtilis RecQ S和B.subtilis RecQ L的全基因片段,并用重叠PCR定点突变法将两种RecQ基因片段中的两个精氨酸残基分别进行单突变和双突变,并将野生型和突变型基因克隆入原核表达载体pET24a (+)中,连接产物转化入感受态E.coli DH5α。挑取单菌落,培养后提取质粒,经菌液PCR和双酶切鉴定,并测序正确后,转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),用IPTG进行低温诱导表达,结果发现所有目的蛋白主要以可溶形式存在于菌体中。优化表达条件后,经亲和层析纯化获得纯度大于90%的目标蛋白质,检测野生型和突变型蛋白的生化活性。结果表明,Bacillus subtilis RecQ解旋酶具有DNA依赖性和蛋白浓度依赖性的ATP水解活性。两个精氨酸残基突变后,RecQ酶的ATP水解活性明显减弱,表明这两个精氨酸残基参与RecQ酶与ATP的相互作用。然后采用ATP水解活性抑制剂—原钒酸盐(Vi)来确定枯草杆菌RecQ解旋酶中的精氨酸指位置,通过实验可确定B.subtilis RecQ S R322和B.subtilis RecQ L R323为精氨酸指结构。为了能够更加直观观察RecQ酶与DNA的相互作用,本实验使用EMSA和荧光偏振法的方法来进行检测。但由于EMSA的灵敏度不高,则通过灵敏度更高的荧光偏振法来检测枯草杆菌RecQ解旋酶精氨酸突变体的DNA结合活性。实验证明Bacillus subtilis RecQ解旋酶对DNA的结合活性具有蛋白浓度依赖性。将精氨酸残基突变后,可能影响了DNA结合到RecQ酶上的能力,说明R319,R322,R320和R323都参与RecQ酶与DNA的相互作用,此精氨酸残基能促进RecQ酶对DNA的结合作用。本文还采用FRET原理来测定DNA的解旋活性,退火活性以及ATP结合活性。将精氨酸残基突变后,Bacillus subtilis RecQ酶对DNA解旋和ATP结合活性明显降低,说明此精氨酸残基能促进RecQ酶对DNA解旋和ATP的结合作用。但是对于DNA的退火活性只是在一定程度上受到影响,说明精氨酸残基并不参与酶对DNA的退火配对作用。除此之外,本文还将Bacillus subtilis RecQ L中的HRDC区域进行截断,并将该基因进行克隆,克隆完成后,进行蛋白表达和纯化。实验结果说明HRDC区域对枯草杆菌RecQ解旋酶的各种生物活性起到辅助作用。本实验的意义在于为研究RecQ解旋酶家族其他重要成员的活性功能提供了理论依据。