近年来,关于戊型肝炎(HE)的报道越来越多。在发展中国家,戊型肝炎病毒(HEV)会通过粪-口途径引起水源性的大规模爆发以及一些急性自发性的散发病例。戊型肝炎病毒是引起本地流行和自限性散发疾病的原因,当然也会导致急性肝炎,少数的暴发性肝衰竭以及在中晚期孕妇人群中引起高达20%的致死率,这给我们的社会带来了极大的危害。HEV属于肝炎病毒科,戊型肝炎病毒属家族。该病毒为一大小约27-34nm的非包膜单股正链RNA病毒,其RNA长约7.2kb,有三个开放读码框(ORFs),ORF1编码与病毒复制有关的非结构聚合蛋白;ORF2编码与病毒组装和免疫原性有关的衣壳蛋白;ORF3编码一个多功能的磷酸蛋白,其与细胞内的信号转导、诱导宿主的炎症反应和保护被病毒感染的细胞有关。ORF3在N端包含两个疏水结构域D1和D2,在C端包含两个富含脯氨酸的结构域P1和P2。HEV分为4个基因型,但只有一个血清型,基因1型和2型仅感染人类,3型和4型属于人畜共患型。基因1型在流行地区通常引起大规模的流行。其在青年人中有很高的急性肝炎发病率、在孕期导致更高的发病率和死亡率以及一定比例的爆发性肝衰竭。然而,由于缺乏有效的细胞模型,HEV的致病机制尚不清楚。有报道称其机制并不是直接的病毒复制造成的,而是由细胞免疫反应介导的。最近,戊肝有效的细胞培养体系在人肺癌细胞A549中成功建立,我们课题组前期实验证实在A549细胞中1型HEV ORF3可以抑制TNF-α诱导的NF-κ B活化,然而ORF3在其他信号途径中的确切功能尚不清楚。由于缺乏有效的体内模型,此研究的目的是在细胞水平研究1型HEV ORF3在TLRs诱导的NF-κ B信号途径中的作用。总所周知,天然免疫是免疫系统的第一道防线。宿主的天然免疫系统通过不同的模式识别受体来识别微生物的病原相关分子模式,其中TLRs是第一个被发现的模式识别受体。来源于病毒的核酸招募数个TLRs,其中,双链RNA病毒是被TLR3鉴别,单链RNA病毒是被TLR7和TLR8鉴别,而非甲基化的CpG DNA病毒则是由TLR9鉴别。这些TLRs在未受刺激的细胞中定位在内质网上,一旦活化,就定位到内体,在这里经过蛋白酶处理,然后在高尔基体遇到内化的核酸配体。个体TLRs通过招募MyD88或者TRIF促发特异性的应答,除了 TLR3是用TRIF依赖的信号途径外,其余的TLRs都是用MyD88依赖的信号途径。同时RIG-I样受体(RLRs),包括RIG-I,Mda5和LGP2,也是感知胞浆内的病毒的。为了应答病毒的遗传物质,宿主会诱导依赖IRF3/7的IFN产生和NF-κ B途径诱导的炎症因子和趋化因子来干扰病毒复制。NF-κB是一个调节多个生理功能的转录因子,其功能包括免疫应答,抗凋亡和炎症反应。在TLRs和RLRs信号途径中,异源二聚体(P65/P50)是最常见的活化形式。在未受刺激的细胞中,P65/P50被NF-κ B的抑制蛋白I κ B蛋白隔绝在胞浆,诱导刺激后由I κ B激酶(IKK)复合物磷酸化I κ B,导致I κ B蛋白K48泛素化随后被蛋白酶降解。结果是P65被释放转运到胞核,进而促进炎症靶基因的表达。在这个过程中,TRADD-RIP1复合物是ORF3发挥抑制作用的关键角色,其中TRADD作为联络者和RIP1作为实施者一起使信号传递。在受体系统中,泛素化是对靶蛋白的一种重要的生理修饰方式,用来调节信号转导。K48泛素化是用蛋白酶系统识别靶蛋白,将其降解;而K63泛素化是促进蛋白与蛋白的连接和信号传导。我们研究发现,1型HEV ORF3能够抑制TLR3介导的NF-κ B信号通路的活化。我们将带有绿色荧光蛋白(GFP)的ORF3在A549细胞中过表达,然后用与病毒核酸相关的不同的TLRs激动剂刺激细胞,通过蛋白质免疫印迹(western blot)和免疫荧光试验(Immunofluorescence Assay)来观察p65(NF-κB亚单位)在胞浆和胞核的分布情况来评价NF-κ B的活化程度。通过shRNAs基因干扰手段发现ORF3抑制NF-κ B信号通路的活化是通过TLR3介导的途径而不是RIG-I介导的途径。这种抑制作用在ELISA和RT-PCR实验中TNF-α,IL-8和IL-1 β(NF-κ B靶基因)表达水平的变化得到了验证。同时,我们通过双荧光素酶报告试验发现ORF3的P2区域是其发挥抑制作用的关键区域。进一步免疫共沉淀研究发现,TRADD和RIP1与TLR3形成复合物,ORF3使TRADD的表达量减少,RIP1的K63泛素化减弱。此外,我们还印证了 RIP1中间结构域的赖氨酸377位点是ORF3发挥抑制作用的功能性位点。综上所述,我们的研究表明,1型HEV ORF3是通过TRADD-RIPI复合物抑制了 TLR3介导的NF-κ B信号通路的活化。本研究发现HEVORF3能够促进戊肝病毒复制,提出了新的理论观点,加深了戊肝病毒在细胞内致病机制的理解,为临床抗击戊肝感染提供了新的治疗方向。