槲皮素和其代谢物槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷对大鼠体内环孢素A药动学的影响及机制研究

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目的:  建立测定大鼠全血中环孢素A的高效液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)分析方法,研究槲皮素及其代谢物槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷对大鼠体内环孢素A药动学的影响,并通过检测经槲皮素和槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷给药处理后的大鼠肝脏和小肠中CYP3A1/2和P-gp的mRNA的表达和蛋白的表达,探索槲皮素和槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷对大鼠体内环孢素A药动学影响的作用机制。  方法:  (一)建立测定环孢素A的LC-M S/M S分析方法  使用Waters ACQUITY超高效液相色谱仪和API4000型三重四极杆串联质谱仪进行分析;色谱柱为Inertsil ODS-SP(100mm×2.1mm),柱温为60℃,流动相为甲醇-含0.1%甲酸的10mmol·L-1乙酸铵(90∶10,v/v),内标为环孢素D;质谱检测采用电喷雾离子源的正离子模式及质谱多反应监测(M RM)扫描模式,监测质荷比:环孢素A为1220.1/1203.2,环孢素D为1234.1/1217.2。  (二)槲皮素对大鼠体内环孢素A药动学的影响及机制研究  1.槲皮素对大鼠体内环孢素A药动学的影响  选用SD雄性大鼠为研究对象,将24只大鼠随机分为3组:①槲皮素低剂量组(Que-L,25mg·kg-1),②槲皮素中剂量组(Que-M,50mg·kg-1),③槲皮素高剂量组(Que-H,100mg·kg-1)。采用自身对照法,第1天早晨将每只大鼠称量体重后灌胃给予环孢素A,给药剂量为10mg·kg-1,于0.5、1、2、4、6、8、12、24、36、48h采血,第3天采血后30min内按照分组分别灌胃给予不同剂量的槲皮素,第4天~第9天每天早晨用不同剂量的槲皮素给药处理。于第9天给药30min后每只大鼠都灌胃给予环孢素A,给药剂量为10mg·kg-1,于0.5、1、2、4、6、8、12、24、36、48h采血,用LC-MS/MS法测定全血中环孢素A的浓度。  2.槲皮素对大鼠体内环孢素A药动学影响的作用机制研究  将24只SD雄性大鼠随机分为8组:①空白对照组[Que溶媒+CsA溶媒];②环孢素组[CsA(10mg·kg-1)+Que溶媒];③槲皮素低剂量组[Que-L(25mg·kg-1)+CsA溶媒];④槲皮素低剂量+环孢素组[Que-L(25mg·kg-1)+CsA(10mg·kg-1)];⑤槲皮素中剂量组[Que-M(50mg·kg-1)+CsA溶媒];⑥槲皮素中剂量+环孢素组[Que-M(50mg·kg-1)+CsA(10mg·kg-1)];⑦槲皮素高剂量组[Que-H(100mg·kg-1)+CsA溶媒];⑧槲皮素高剂量+环孢素组[Que-H(100mg·kg-1)+CsA(10mg·kg-1)];连续每天清晨灌胃给药7天。在第7天清晨给药后24h将大鼠小肠和肝脏取出处理后冻存,采用实时荧光定量PCR和Western blot的方法检测肝脏和小肠中P-gp和CYP3A1/2的mRN A和蛋白的表达。  (三)槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷对大鼠体内环孢素A药动学的影响及机制研究  1.槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷对大鼠体内环孢素A药动学的影响  将36只SD雄性大鼠随机分为6组:①空白对照组(Q3GA溶媒,5mL·kg-1);②酮康唑组(KET,75mg·kg-1);③维拉帕米组(VER,4mg·kg-1);④槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷低剂量组(Q3GA-L,2.5mg·kg-1);⑤槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷中剂量组(Q3GA-M,5mg·kg-1);⑥槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷高剂量组(Q3GA-H,10mg·kg-1);qd,①④⑤⑥组连续每天清晨尾静脉注射给药7天,②③组连续每天清晨灌胃给药7天。在第7天清晨给药30min后每只大鼠都灌胃给予环孢素A,给药剂量为10mg·kg-1,于0.33、0.67、1、1.5、2、4、8、12、24、36、48h采血。用LC-MS/MS法测定全血中环孢素A的浓度。  2.槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷对大鼠体内环孢素A药动学影响的作用机制研究  将18只SD雄性大鼠随机分为6组,分组同上,连续每天清晨给药7天。在第7天清晨给药30min后每只大鼠都灌胃给予环孢素A溶媒,24h后将大鼠小肠和肝脏取出处理后冻存,采用实时荧光定量PCR和Western blot的方法检测肝脏和小肠中P-gp、CYP3A1/2、CAR和PXR的mRNA和蛋白的表达。  结果:  本方法专属性良好,线性范围为5~4000ng·mL-1,定量下限为5ng·mL-1,批内及批间精密度(RSD%)均<15%,提取回收率为56.90%~63.63%,低、中、高三个质控样品的内标归一化基质因子分别为0.90、0.91、0.81,残留可忽略。环孢素A样品4℃进样器放置8h、室温放置7h、反复冻融3次、长期-80℃冷冻50天的稳定性及储备液的稳定性均良好。  经槲皮素低、中、高剂量(25mg·kg-1、50mg·kg-1、100mg·kg-1)连续7天给药处理后,大鼠环孢素A的Cmax分别显著下降了46%(P<0.001)、50%(P<0.01)、47%(P<0.01),AUC(0-t)和AUC(0-∞)分别下降了21%和16%、30%和33%、33%(P<0.01)和34%(P<0.01),而Tmax、CL/F和t1/2没有显著差异。实时荧光定量PCR和Western blot的实验结果表明槲皮素显著抑制肝脏和小肠中CYP3A1/2和P-gp的mRN A和蛋白的表达水平。  经槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷低、中、高剂量(2.5mg·kg-1、5mg·kg-1、10mg·kg-1)连续7天给药处理后,与空白对照组相比,大鼠环孢素A的Cmax分别下降了33%、34%、40%,AUC(0-t)和AUC(0-∞)分别下降了34%和35%、36%和35%、48%和46%,均没有显著差异。与空白对照组相比,中和高剂量组的大鼠环孢素A的CL/F分别增加了73%和80%,V/F分别增加了103%(P<0.01)和93%(P<0.05),所有组的Tmax和t1/2都没有显著性差异。时荧光定量PCR和Western blot的实验结果表明槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸显著抑制大鼠肝脏和小肠中CYP3A1/2和P-gp的mRNA和蛋白表达水平,并上调PXR受体和CAR受体的mRNA和蛋白表达水平。  结论:  槲皮素和其代谢物槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷连续给药降低大鼠体内环孢素A的生物利用度,槲皮素和槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷抑制大鼠肝脏和小肠中CYP3A1/2和P-gp的mRNA和蛋白的表达水平,槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷上调PXR受体和CAR受体的mRNA和蛋白的表达水平。槲皮素和槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷抑制CYP3A和P-gp、核受体激活CYP3A和P-gp以及CYP3A和P-gp之间的相互作用可能是槲皮素和槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷对大鼠体内环孢素A药动学影响的复杂作用机制。
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