“营卫理论”为中医脉络学说的核心理论,营行脉中,卫行脉外,营卫之气在脉络的末端—孙络发生交会生化,与西医学微循环末端发生的物质交换与能量代谢过程相吻合,其中微血管内皮细胞对维持上述生理功能发挥着重要作用,对于揭示疾病的微血管发病机制具有重要价值。本研究以脉络学说营卫“由络以通,交会生化”理论为指导,基于营气与血管内皮、卫气与血管外膜及全身性神经-内分泌-免疫网络(NEI)相关性,建立同型半胱氨酸(Hcy)诱导的心肌微血管内皮细胞损伤模型,观察其条件培养液对心肌细胞的损伤作用;探讨通心络通过保护受损的心肌微血管内皮细胞减轻心肌细胞损伤的可能机制,为营卫“由络以通、交会生化”理论提供实验数据支持,也为从“孙络—微血管”完整性保护角度治疗血管病变开辟新途径。第一部分同型半胱氨酸诱导损伤的心肌微血管内皮细胞对心肌细胞的影响目的:探讨受损的心肌微血管内皮细胞条件培养液能否引起心肌细胞的损伤。方法:植块法原代提取大鼠心肌微血管内皮细胞(RCMECs)并采用免疫荧光法鉴定,10 mmol/L的Hcy干预RCMECs 24 h建立心肌微血管内皮细胞损伤模型,同时设立正常对照组。CCK-8法检测两组RCMECs生存活性;可见分光光度法、硝酸还原酶法和酶联免疫吸附法分别检测两组RCMECs上清液LDH、NO及ET-1含量。分别收取正常的RCMECs条件培养液(N-CM)和同型半胱氨酸诱导损伤的RCMECs条件培养液(H-CM)。将H9c2心肌细胞分为正常对照组(Normal)、N-CM组和H-CM组。倒置显微镜观察各组细胞形态变化;CCK-8法检测各组细胞生存活性;酶联免疫分析法检测各组细胞上清液c Tn T含量。结果:1大鼠心肌微血管内皮细胞的形态及鉴定结果植块法分离的RCMECs培养至24 h时,可见组织块周围有未融合的心肌微血管内皮细胞,其形态呈星型、梭形或多角形,吸弃组织块、换新鲜培养基继续培养至96 h,细胞汇合成铺路石样。CD31免疫荧光鉴定结果显示所提取的RCMECs纯度大于95%。2两组大鼠心肌微血管内皮细胞生存活性比较与Normal组比较,Hcy组细胞生存活性降低(P<0.01)。3两组大鼠心肌微血管内皮细胞上清液LDH含量比较与Normal组比较,Hcy组细胞上清液LDH含量升高(P<0.01)。4两组大鼠心肌微血管内皮细胞上清液NO和ET-1含量比较与Normal组比较,Hcy组细胞上清液NO含量降低(P<0.01),ET-1含量升高(P<0.01)。5各组H9c2心肌细胞形态变化Normal组细胞呈短梭形或不规则三角形,边缘清楚,细胞核呈卵圆形居中;与Normal组比较,N-CM组细胞形态无明显变化;与N-CM组比较,H-CM组细胞核浓缩,细胞边缘模糊,体积缩小,呈团簇状,有较多细胞脱落,细胞数量明显减少,损伤严重。6各组H9c2心肌细胞生存活性比较与Normal组比较,N-CM组细胞生存活性无明显变化(P>0.05);与N-CM组比较,H-CM组细胞生存活性降低(P<0.01)。7各组H9c2心肌细胞上清液c Tn T含量比较与Normal组比较,N-CM组细胞上清液c Tn T含量无明显变化(P>0.05);与N-CM组比较,H-CM组细胞上清液c Tn T含量升高(P<0.01)。小结:同型半胱氨酸可诱导大鼠心肌微血管内皮细胞损伤,其条件培养液对心肌细胞具有损伤作用。第二部分通心络对同型半胱氨酸诱导损伤的心肌微血管内皮细胞的保护作用目的:探讨通心络对受损心肌微血管内皮细胞的保护作用及机制。方法:RCMECs分为5组:正常对照组(Normal)、同型半胱氨酸组(Hcy)、通心络低浓度组(TXL-L)、通心络中浓度组(TXL-M)、通心络高浓度组(TXL-H)。CCK-8法检测各组细胞生存活性;羟胺法检测细胞上清液中SOD的活性;TBA法检测细胞上清液中MDA的含量;酶联免疫法检测细胞上清液中IL-6和ICAM-1的含量;流式细胞仪检测细胞ROS水平及凋亡率;RT-PCR检测细胞ET-1 m RNA表达;Western Blot检测细胞e NOS和NF-κB蛋白表达。RCMECs分为7组:正常对照组(Normal)、Hcy干预5 h组(Hcy 5h)、Hcy干预5 h+TXL组(Hcy 5 h+TXL)、Hcy干预10 h组(Hcy 10 h)、Hcy干预10 h+TXL组(Hcy 10 h+TXL)、Hcy干预20 h组(Hcy 20 h)、Hcy干预20 h+TXL组(Hcy 20 h+TXL)。采用高内涵细胞分析系统检测GRP78蛋白表达。RCMECs分为5组:正常对照组(Normal)、Hcy组、Hcy+TXL组、Hcy+LY294002组(LY294002为PI3K抑制剂)及Hcy+LY294002+TXL组。采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率;RT-PCR及Western Blot法检测细胞GRP78、CHOP及caspase-12 m RNA及蛋白表达,Western Blot法检测p-PI3K、t-PI3K、p-Akt及t-Akt蛋白表达。结果:1各组大鼠心肌微血管内皮细胞生存活性比较与Normal组比较,Hcy组细胞生存活性降低(P<0.01);与Hcy组比较,TXL-H组细胞生存活性升高(P<0.01)。2各组大鼠心肌微血管内皮细胞e NOS蛋白表达比较与Normal组比较,Hcy组细胞e NOS蛋白表达下调(P<0.01);与Hcy组比较,TXL-L组、TXL-M组及TXL-H组细胞e NOS蛋白表达上调(P<0.01);与TXL-L组比较,TXL-M组及TXL-H组细胞e NOS蛋白表达上调(P<0.01);与TXL-M组比较,TXL-H组细胞e NOS蛋白表达上调(P<0.05)。3各组大鼠心肌微血管内皮细胞ET-1 m RNA表达比较与Normal组比较,Hcy组细胞ET-1 m RNA表达上调(P<0.01);与Hcy组比较,TXL-L组、TXL-M组及TXL-H组细胞ET-1 m RNA表达上调(P<0.01)。4各组大鼠心肌微血管内皮细胞上清液SOD活性和MDA含量比较与Normal组比较,Hcy组细胞上清液SOD活性降低(P<0.01),MDA含量升高(P<0.01);与Hcy组比较,TXL-L组、TXL-M组及TXL-H组细胞上清液SOD活性升高(P<0.01),TXL-M组及TXL-H组细胞上清液MDA含量降低(P<0.01);与TXL-L组比较,TXL-H组细胞上清液SOD活性升高(P<0.05),TXL-M组及TXL-H组细胞上清液MDA含量降低(P<0.01);与TXL-M组比较,TXL-H组细胞上清液MDA含量降低(P<0.01)。5各组大鼠心肌微血管内皮细胞ROS水平比较与Normal组比较,Hcy组细胞ROS水平升高(P<0.05);与Hcy组比较,TXL-H组细胞ROS水平降低(P<0.05)。6各组大鼠心肌微血管内皮细胞上清液IL-6和ICAM-1含量比较与Normal组比较,Hcy组细胞上清液IL-6和ICAM-1含量升高(P<0.01);与Hcy组比较,TXL-M组及TXL-H组细胞上清液IL-6和ICAM-1含量降低(P<0.01);与TXL-M组比较,TXL-H组细胞上清液IL-6和ICAM-1含量降低(P<0.05)。7各组大鼠心肌微血管内皮细胞NF-κB蛋白表达比较与Normal组比较,Hcy组细胞NF-κB蛋白表达上调(P<0.01);与Hcy组比较,TXL-L组、TXL-M组及TXL-H组细胞NF-κB蛋白表达下调(P<0.01);与TXL-L组比较,TXL-M组及TXL-H组细胞NF-κB蛋白表达下调(P<0.01);与TXL-M组比较,TXL-H组细胞NF-κB蛋白表达下调(P<0.05)。8各组大鼠心肌微血管内皮细胞GRP78蛋白表达比较与Normol组比较,Hcy 5 h组细胞GRP78蛋白表达无明显变化(P>0.05),Hcy 10 h组及Hcy 20 h组细胞GRP78蛋白表达上调(P<0.01);与Hcy 10 h组比较,Hcy 10 h+TXL组细胞GRP78蛋白表达下调(P<0.01);与Hcy 20 h组比较,Hcy 20 h+TXL组细胞GRP78蛋白表达下调(P<0.01)。9各组大鼠心肌微血管内皮细胞p-PI3K、t-PI3K、p-Akt和t-Akt蛋白表达比较与Normal组比较,Hcy组细胞p-PI3K和p-Akt蛋白表达下调(P<0.05,P<0.01),t-PI3K和t-Akt蛋白表达无明显变化(P>0.05);与Hcy组比较,Hcy+TXL组细胞p-PI3K和p-Akt蛋白表达上调(P<0.05,P<0.01),t-PI3K和t-Akt蛋白表达无明显变化(P>0.05);与Hcy+TXL组比较,Hcy+LY294002组及Hcy+LY294002+TXL组细胞p-PI3K和p-Akt蛋白表达下调(P<0.01),t-PI3K和t-Akt蛋白表达无明显变化(P>0.05)。10各组大鼠心肌微血管内皮细胞凋亡率比较与Normal组比较,Hcy组细胞凋亡率升高(P<0.01);与Hcy组比较,Hcy+TXL组细胞凋亡率降低(P<0.01),Hcy+LY294002+TXL组细胞凋亡率降低(P<0.01),Hcy+LY294002组细胞凋亡率无明显变化(P>0.05);与Hcy+TXL组比较,Hcy+LY294002+TXL组细胞凋亡率升高(P<0.01)。11各组大鼠心肌微血管内皮细胞GRP78、CHOP、Caspase-12 m RNA及蛋白表达比较与Normal组比较,Hcy组细胞GRP78、CHOP和Caspase-12 m RNA及蛋白表达上调(P<0.01);与Hcy组比较,Hcy+TXL组和Hcy+LY294002+TXL组细胞GRP78、CHOP和Caspase-12 m RNA及蛋白表达下调(P<0.01),Hcy+LY294002组细胞GRP78、CHOP和Caspase-12m RNA及蛋白表达无明显变化(P>0.05);与Hcy+TXL组比较,Hcy+LY294002+TXL组细胞GRP78、CHOP和Caspase-12 m RNA及蛋白表达上调(P<0.01)。小结:通心络可明显改善受损心肌微血管内皮细胞的生存活性及分泌功能,与其抑制细胞的氧化和炎症损伤有关;通心络还可通过改善PI3K/Akt通路的活性抑制内质网应激介导的心肌微血管内皮细胞凋亡。第三部分通心络干预的心肌微血管内皮细胞条件培养液对心肌细胞的保护作用目的:明确通心络通过改善心肌微血管内皮细胞的分泌功能对心肌细胞的间接保护作用。方法:将H9c2心肌细胞分为4组:正常对照组(Normal)、正常RCMECs条件培养液组(N-CM)、Hcy诱导损伤的RCMECs条件培养液组(H-CM)和通心络干预的RCMECs条件培养液组(T-CM)。CCK-8法检测各组细胞生存活性;酶联免疫法检测细胞上清液c Tn T含量;JC-1试剂检测细胞线粒体膜电位;流式细胞仪检测细胞ROS水平;Western Blot检测细胞Cyt C、CRT、Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达;细胞免疫荧光染色法检测细胞CRT蛋白表达;活细胞成像系统动态观察各组细胞的凋亡变化。1各组H9c2心肌细胞生存活性比较与Normal组比较,N-CM组细胞生存活性无明显变化(P>0.05);与N-CM组比较,H-CM组细胞生存活性降低(P<0.01);与H-CM组比较,T-CM组细胞生存活性升高(P<0.01)。2各组H9c2心肌细胞上清液c Tn T含量比较与Normal组比较,N-CM组细胞上清液c Tn T含量无明显变化(P>0.05);与N-CM组比较,H-CM组细胞上清液c Tn T含量升高(P<0.01);与H-CM组比较,T-CM组细胞上清液c Tn T含量降低(P<0.01)。3各组H9c2心肌细胞线粒体膜电位(MMP)比较与Normal组比较,N-CM组细胞MMP无明显变化(P>0.05);与N-CM组比较,H-CM组细胞MMP降低(P<0.01);与H-CM组比较,T-CM组细胞MMP升高(P<0.01)。4各组H9c2心肌细胞ROS水平比较与Normal组比较,N-CM组细胞ROS水平无明显差异(P>0.05);与N-CM组比较,H-CM组细胞ROS水平升高(P<0.01);与H-CM组比较,T-CM组细胞ROS水平降低(P<0.05)。5各组H9c2心肌细胞钙网蛋白(CRT)蛋白表达比较与Normal组比较,N-CM组细胞CRT蛋白表达无明显差异,均较弱;与N-CM组比较,H-CM组细胞CRT蛋白表达明显上调,且细胞出现皱缩;与H-CM组比较,T-CM组细胞CRT蛋白表达下调,细胞皱缩明显减轻。6各组H9c2细胞CRT及细胞色素C(Cyt C)蛋白表达比较与Normal组比较,N-CM组细胞CRT及Cyt C蛋白表达水平无明显变化(P>0.05);与N-CM组比较,H-CM组细胞CRT及Cyt C蛋白表达上调(P<0.01);与H-CM组比较,T-CM组细胞CRT及Cyt C蛋白表达下调(P<0.05,P<0.01)。7活细胞成像系统动态观察各组H9c2心肌细胞凋亡变化活细胞成像系统动态观察15 h,发现Normal组细胞存活状态良好,细胞核圆润无皱缩,边缘清晰,荧光强度均一,部分细胞出现分裂增殖现象,极少数细胞凋亡(蓝色为细胞核);与Normal组比较,N-CM组细胞状态无明显差异,部分细胞分裂增殖,极少数细胞凋亡;与N-CM组比较,H-CM组细胞5 h内有极少数细胞分裂增殖,5 h开始出现细胞凋亡,5 h至15 h过程中部分细胞核皱缩、浓染,细胞核体积变小,核碎裂,出现凋亡小体,细胞凋亡明显,连续观察至15 h细胞数量也明显减少;与H-CM组比较,T-CM组细胞5 h未出现明显的凋亡,有少数细胞分裂增殖,细胞状态良好,5 h至15 h过程中有部分细胞核皱缩、碎裂,出现凋亡小体,细胞凋亡,但凋亡细胞数量明显减少。8各组H9c2心肌细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达比较与Normal组比较,N-CM组细胞Caspase-3、Bax及Bcl-2蛋白表达水平无明显变化(P>0.05);与N-CM组比较,H-CM组细胞Caspase-3和Bax蛋白表达上调(P<0.01),Bcl-2蛋白表达下调(P<0.01);与H-CM组比较,T-CM组细胞Caspase-3和Bax蛋白表达下调(P<0.05,P<0.01),Bcl-2蛋白表达上调(P<0.01)。小结:通心络干预的心肌微血管内皮细胞条件培养液能够提高受损心肌细胞的生存活性、改善线粒体功能、抑制细胞凋亡,进而保护心肌细胞。结论:1本研究以脉络学说营卫“由络以通,交会生化”理论为指导,基于营气与血管内皮、卫气与血管外膜及神经-内分泌-免疫网络(NEI)相关性,以及“孙络—微血管”解剖形态学同一性,探讨同型半胱氨酸诱导的心肌微血管内皮细胞损伤对心肌细胞的作用及通络药物干预机制,为营卫“由络以通、交会生化”理论提供实验数据支持,也为从“孙络—微血管”完整性保护角度治疗血管病变开辟新途径。2同型半胱氨酸诱导心肌微血管内皮细胞损伤的条件培养液可降低心肌细胞生存活性、抑制线粒体功能、促进心肌细胞凋亡,提示心肌微血管内皮细胞的分泌功能障碍可介导心肌细胞损伤,这与脉络末端“孙络—微血管”营卫交会生化功能异常所引起的脏腑组织病理损伤的过程相吻合。3通心络能够减少心肌微血管内皮细胞的氧化和炎症损伤、抑制细胞凋亡,从而改善心肌微血管内皮细胞的分泌功能。通心络对心肌微血管内皮细胞分泌功能的调节作用可进一步提高受损心肌细胞的生存活性、改善线粒体功能、抑制细胞凋亡,进而保护心肌细胞,显示通络药物可通过保护“孙络—微血管”改善脏腑组织的病理损伤。