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目的
本课题为课题组项目“基于微透析采样技术的谱动学研究”的前期方法学研究工作，在课题组前期研究“四逆汤指标成分的高效液相分析方法及复方指纹图谱建立”的基础上，利用高效液相色谱仪(HPLC)对微透析样品进行分析，考察内标微透析法应用于四逆汤指标成分采样的可行性，建立内标微透析技术用于四逆汤体内外微透析样品的采集方法，为后续微透析的体内采样奠定基础。利用液质联用仪(UPLC-TOF-MS/MS)检测四逆汤在大鼠血液与心脏透析液中的化学成分，分析各成分随时间的变化规律，为内标微透析技术在中药复方多成分体内动态分析中的应用提供参考，为课题组后期“结合微透析技术的四逆汤谱动学研究”提供研究基础。
方法
1.四逆汤指标成分HPLC分析方法与指纹图谱的建立
建立四逆汤指标成分甘草苷、苯甲酰新乌头原碱、6-姜酚的HPLC检测方法，确定色谱条件，绘制标准曲线，测定精密度、稳定性、定量限及检测限，建立四逆汤复方的指纹图谱。
2.内标微透析灌流液改性剂的筛选
以20％、30％、40％的乙醇，0.5％、1.0％、2.0％的甘油，5％、10％、15％的β-环糊精(β-CD)作为灌流液改性剂，以苯甲酰新乌头原碱和氢溴酸高乌甲素为指标成分，考察流速分别为0.5、1.0、1.5、2.0μL/min的条件下，9种改性剂对探针回收率的影响，筛选出对回收率增加作用最明显且作用稳定的灌流液改性剂。
3.内标微透析法用于四逆汤体内外采样的可行性研究
以甘草苷、苯甲酰新乌头原碱、6-姜酚为四逆汤的指标成分，氢溴酸高乌甲素为内标物，分别考察四种流速(0.5μL/min、1.0μL/min、1.5μL/min、2.0μL/min)、浓度(C1、C2、C3、C4)及温度(30℃、33℃、37℃、40℃)对指标成分在血液探针与线性探针中的回收率及P(P)值的影响，并验证10h内指标成分在体外和体内P值的稳定性。
4.四逆汤在大鼠血液与心脏透析液的化学成分分析
将四逆汤灌胃给予大鼠后，利用内标微透析技术采集10h内血液与心脏的透析液，用UPLC/Q-TOF-MS/MS检测四逆汤在大鼠体内的原型化学成分，分析各成分随时间的变化，从化学成分的角度研究四逆汤复方多成分的动态变化规律，进一步验证所建立的内标微透析技术的可行性。
结果
1.四逆汤HPLC分析方法及指纹图谱的建立
采用HPLC条件如下:岛津LC-20A高效液相色谱仪;Kromasil100-5-C18色谱柱(4.6mm×150mm，5μm);流动相:乙腈-0.1％磷酸水;流速:0.8mL/min;检测波长:230nm;柱温:30℃;洗脱梯度:0.01-18min，95％-81％(A);18-42min，81％-78％(A);42-52min,78％-65％(A);52-80min,65％-35％(A);80-85min,35％-35％(A);A为0.1％磷酸水。建立的四逆汤指纹图谱有24个共有峰，该方法的稳定性、重复性良好。
2.30％乙醇可作为最佳灌流液改性剂
以20％、30％、40％的乙醇，0.5％、1.0％、2.0％的甘油，5％、10％、15％的β-CD分别作为灌流液改性剂，测定苯甲酰新乌头原碱与内标物氢溴酸高乌甲素的回收率，结果表明9种改性剂对两种成分的回收率均有不同程度的增强作用，其中30％乙醇的增强效果最显著且能随流速呈现稳定的变化规律。
3.内标微透析法应用于四逆汤体内外采样具有可行性
内标微透析法采样条件为:以含有内标物氢溴酸高乌甲素的改性林格氏液为灌流液，流速1.0μL/min，采样间隔30min，每份样品30μL。流速为0.5、1.0、1.5、2.0μL/min时，在血液探针中用增量法与减量法测得甘草苷回收率分别为86.71％、94.39％，61.48％、64.21％，44.20％、42.95％，27.08％、32.42％;苯甲酰新乌头原碱回收率分别为80.24％、86.45％，62.02％、52.65％，42.51％、37.66％，25.90％、29.30％;6-姜酚回收率分别为77.00％、79.75％，70.31％、78.22％，62.61％、58.54％，44.55％、43.23％;氢溴酸高乌甲素回收率分别为87.50％、85.30％，71.53％、63.77％，45.16％、40.15％，31.04％、26.32％;流速为0.5、1.0、1.5、2.0μL/min时，在线性探针中用增量法与减量法测得甘草苷回收率分别为87.19％、77.22％，71.50％、61.31％，51.62％、42.55％，43.37％、33.24％;苯甲酰新乌头原碱回收率分别为71.80％、60.12％，66.10％、55.86％，51.86％、40.47％，41.71％、33.17％;6-姜酚回收率分别为86.95％、74.80％，73.56％、67.22％，52.03％、42.38％，41.51％、31.33％;氢溴酸高乌甲素回收率分别为62.27％、56.79％，42.71％、53.51％，30.10％、37.91％，25.44％、30.36％。流速、温度、浓度的变化对P(P)值的影响均在较稳定范围内，各指标成分在血液探针和线性探针的P值10h内波动较小，能维持良好的稳定性。
4.四逆汤在大鼠血液与心脏透析液中的化学成分分析
利用UPLC-TOF-MS/MS在四逆汤体外透析液中鉴定出38个化合物，通过微透析体内采样10h后，在大鼠血液中鉴定出四逆汤原型成分25个，心脏中鉴定出原型成分21个;在血液与心脏透析液中，四逆汤的各个化学成分随时间动态变化均表现出不同规律。
结论
1.在既定色谱条件下，四逆汤各主成分峰分离良好，峰型对称，线性范围、精密度、稳定性等均符合实验要求。
2.30％乙醇可作为本研究中最佳的灌流液改性剂，用于提高四逆汤中亲脂性成分的回收率。
3.以氢溴酸高乌甲素为内标物进行四逆汤的微透析采样具有可行性。
4.四逆汤中各化学成分在大鼠体内均随时间呈现不同动态变化规律，微透析适用于四逆汤化学成分体内动态变化分析。
本课题为课题组项目“基于微透析采样技术的谱动学研究”的前期方法学研究工作，在课题组前期研究“四逆汤指标成分的高效液相分析方法及复方指纹图谱建立”的基础上，利用高效液相色谱仪(HPLC)对微透析样品进行分析，考察内标微透析法应用于四逆汤指标成分采样的可行性，建立内标微透析技术用于四逆汤体内外微透析样品的采集方法，为后续微透析的体内采样奠定基础。利用液质联用仪(UPLC-TOF-MS/MS)检测四逆汤在大鼠血液与心脏透析液中的化学成分，分析各成分随时间的变化规律，为内标微透析技术在中药复方多成分体内动态分析中的应用提供参考，为课题组后期“结合微透析技术的四逆汤谱动学研究”提供研究基础。
方法
1.四逆汤指标成分HPLC分析方法与指纹图谱的建立
建立四逆汤指标成分甘草苷、苯甲酰新乌头原碱、6-姜酚的HPLC检测方法，确定色谱条件，绘制标准曲线，测定精密度、稳定性、定量限及检测限，建立四逆汤复方的指纹图谱。
2.内标微透析灌流液改性剂的筛选
以20％、30％、40％的乙醇，0.5％、1.0％、2.0％的甘油，5％、10％、15％的β-环糊精(β-CD)作为灌流液改性剂，以苯甲酰新乌头原碱和氢溴酸高乌甲素为指标成分，考察流速分别为0.5、1.0、1.5、2.0μL/min的条件下，9种改性剂对探针回收率的影响，筛选出对回收率增加作用最明显且作用稳定的灌流液改性剂。
3.内标微透析法用于四逆汤体内外采样的可行性研究
以甘草苷、苯甲酰新乌头原碱、6-姜酚为四逆汤的指标成分，氢溴酸高乌甲素为内标物，分别考察四种流速(0.5μL/min、1.0μL/min、1.5μL/min、2.0μL/min)、浓度(C1、C2、C3、C4)及温度(30℃、33℃、37℃、40℃)对指标成分在血液探针与线性探针中的回收率及P(P)值的影响，并验证10h内指标成分在体外和体内P值的稳定性。
4.四逆汤在大鼠血液与心脏透析液的化学成分分析
将四逆汤灌胃给予大鼠后，利用内标微透析技术采集10h内血液与心脏的透析液，用UPLC/Q-TOF-MS/MS检测四逆汤在大鼠体内的原型化学成分，分析各成分随时间的变化，从化学成分的角度研究四逆汤复方多成分的动态变化规律，进一步验证所建立的内标微透析技术的可行性。
结果
1.四逆汤HPLC分析方法及指纹图谱的建立
采用HPLC条件如下:岛津LC-20A高效液相色谱仪;Kromasil100-5-C18色谱柱(4.6mm×150mm，5μm);流动相:乙腈-0.1％磷酸水;流速:0.8mL/min;检测波长:230nm;柱温:30℃;洗脱梯度:0.01-18min，95％-81％(A);18-42min，81％-78％(A);42-52min,78％-65％(A);52-80min,65％-35％(A);80-85min,35％-35％(A);A为0.1％磷酸水。建立的四逆汤指纹图谱有24个共有峰，该方法的稳定性、重复性良好。
2.30％乙醇可作为最佳灌流液改性剂
以20％、30％、40％的乙醇，0.5％、1.0％、2.0％的甘油，5％、10％、15％的β-CD分别作为灌流液改性剂，测定苯甲酰新乌头原碱与内标物氢溴酸高乌甲素的回收率，结果表明9种改性剂对两种成分的回收率均有不同程度的增强作用，其中30％乙醇的增强效果最显著且能随流速呈现稳定的变化规律。
3.内标微透析法应用于四逆汤体内外采样具有可行性
内标微透析法采样条件为:以含有内标物氢溴酸高乌甲素的改性林格氏液为灌流液，流速1.0μL/min，采样间隔30min，每份样品30μL。流速为0.5、1.0、1.5、2.0μL/min时，在血液探针中用增量法与减量法测得甘草苷回收率分别为86.71％、94.39％，61.48％、64.21％，44.20％、42.95％，27.08％、32.42％;苯甲酰新乌头原碱回收率分别为80.24％、86.45％，62.02％、52.65％，42.51％、37.66％，25.90％、29.30％;6-姜酚回收率分别为77.00％、79.75％，70.31％、78.22％，62.61％、58.54％，44.55％、43.23％;氢溴酸高乌甲素回收率分别为87.50％、85.30％，71.53％、63.77％，45.16％、40.15％，31.04％、26.32％;流速为0.5、1.0、1.5、2.0μL/min时，在线性探针中用增量法与减量法测得甘草苷回收率分别为87.19％、77.22％，71.50％、61.31％，51.62％、42.55％，43.37％、33.24％;苯甲酰新乌头原碱回收率分别为71.80％、60.12％，66.10％、55.86％，51.86％、40.47％，41.71％、33.17％;6-姜酚回收率分别为86.95％、74.80％，73.56％、67.22％，52.03％、42.38％，41.51％、31.33％;氢溴酸高乌甲素回收率分别为62.27％、56.79％，42.71％、53.51％，30.10％、37.91％，25.44％、30.36％。流速、温度、浓度的变化对P(P)值的影响均在较稳定范围内，各指标成分在血液探针和线性探针的P值10h内波动较小，能维持良好的稳定性。
4.四逆汤在大鼠血液与心脏透析液中的化学成分分析
利用UPLC-TOF-MS/MS在四逆汤体外透析液中鉴定出38个化合物，通过微透析体内采样10h后，在大鼠血液中鉴定出四逆汤原型成分25个，心脏中鉴定出原型成分21个;在血液与心脏透析液中，四逆汤的各个化学成分随时间动态变化均表现出不同规律。
结论
1.在既定色谱条件下，四逆汤各主成分峰分离良好，峰型对称，线性范围、精密度、稳定性等均符合实验要求。
2.30％乙醇可作为本研究中最佳的灌流液改性剂，用于提高四逆汤中亲脂性成分的回收率。
3.以氢溴酸高乌甲素为内标物进行四逆汤的微透析采样具有可行性。
4.四逆汤中各化学成分在大鼠体内均随时间呈现不同动态变化规律，微透析适用于四逆汤化学成分体内动态变化分析。