糖胺聚糖（Glycosaminoglycan,GAG）是一种结构复杂的生物大分子,是由己糖醛酸和己糖胺或它们的硫酸化单糖组成的重复二糖单元形成的一种线性无分支的酸性多糖。糖胺聚糖分布广泛且种类繁多,分为无硫酸修饰的糖胺聚糖（透明质酸）和硫酸修饰的糖胺聚糖硫酸修饰的糖胺聚糖包括硫酸皮肤素/硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素/肝素、硫酸角质素等。肝素（Heparin,HP）是一种重要的糖胺聚糖,是糖链骨架由D-β-葡糖醛酸（或L-α-艾杜糖醛酸）和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位所构成的。肝素可以增强天然丝氨酸蛋白酶抑制剂抗凝血酶Ⅲ的活性,激活抑制内源性凝血途径的所有丝氨酸蛋白酶,因此具有抗凝血的天然活性。临床上作为抗凝血类药物使用已有百年历史。此外,肝素也可以通过结合其他蛋白质来介导各种重要的生理过程,包括脂质运输和吸附、胚胎发育、组织重塑、细菌/病毒感染等。目前,除超低分子量肝素-磺达苷癸钠外,临床使用的肝素类药物全部是基于动物组织提取。动物提取法主要是从猪或牛的小肠粘膜中提取,由于提取方法不同,肝素类产物的结构,分子量和生物学活性各有异同。同时由于动物易患传染性朊病毒病等传染病,还可能引发肝素污染。化学合成或者体外酶法是获得非动物源肝素的技术手段。肝素的结构较为复杂,使用化学合成法延长糖链时,既要考虑对不稳定基团的保护、去保护、活化和偶联,还要考虑区域选择性和立体选择性等情况,合成过程复杂且产率低。近年来,研究人员将目光转向化学酶法合成肝素,该方法使用糖基转移酶合成肝素糖链进而通过异构酶和磺基转移酶催化完成糖链异构化与硫酸化修饰步骤。与化学合成法相比,酶分子底物专一性高,产物结构单一,反应条件十分温和,转化率高。目前化学酶法合成肝素骨架糖链时常用的肝素骨架合酶有 Escherichia coli K5 N-acetylglucosaminyltransferase（KfiA）和来源于Pasteurella multocida的肝素骨架合酶 2（Pasteurella multocida heparosan synthases 2,PmHS2）,其中PmHS2是具有N-乙酰氨基葡萄糖转移酶活性（α-1,4-N-acetylglucosaminytransferase,α-1,4-GlcNAc-T）和葡萄糖醛酸转移酶活性（β-1,4-Glucuronic acid transferase,β-1,4-GlcA-T）的双功能酶,在化学酶法合成体系中得到了广泛的应用。截至本论文写作时,双功能肝素骨架合酶家族仅发现有2个成员,即PmHS2和同样是Pasteurella multocida来源的肝素骨架合酶1（Pasteurella multocida heparosan synthases 1,PmHS1）。本论文致力于发掘更多的双功能肝素骨架合酶家族成员,扩展该类酶的分子结构-催化特性的信息,并通过开展分子改造获得催化活性提升的肝素骨架合成工具酶分子。该论文基于以上背景展开,内容主要包括:1.发掘并确证了两个双功能肝素骨架合酶家族新成员:以PmHS2为基础,在菌株Mter septicus和Psittacicella gerlachiana中发现了两个疑似双功能肝素骨架合酶的基因序列,分别将其命名为MsHS和PgHS。借助大肠杆菌内重组表达体系,成功获得上述两个基因编码的可溶蛋白MsHS和PgHS;以UDP-GlcNAc,GlcA-pNP或UDP-GlcA,GlcNAc-GlcA-pNP 为底物,通过高效液相色谱仪（High-Performance Liquid Chromatography,HPLC）初步确定了 MsHS和PgHS糖基转移酶活性;并通过电喷雾电离质谱（Electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS）和核磁共振（Nuclear magnetic resonance,NMR）确证了其产物的分子量和结构,最终确定了 MsHS和PgHS为新型双功能肝素骨架合酶。2.对双功能肝素骨架合酶MsHS和PgHS的酶学性质进行了研究:系统分析了反应温度,反应pH和体系中金属离子对这两个酶分子催化活性的影响;测定了 MsHS和PgHS的动力学常数（Kcat和km）。数据检测结果表明MsHS的GlcNAc和GlcA转移酶活性的催化效率（Kcat/（kmA*kmD））均高于PmHS2,尤其是GlcNAc转移酶活性的催化效率约为PmHS2的7倍。而PgHS的催化效率相对于PmHS2更小,三者催化效率由高到低为:MsHS＞PmHS2＞PgHS,上述数据为该家族酶分子的改造提供了氨基酸-活性信息。3.扩展PmHS2分子结构-催化特性信息:基于本论文发现家族新成员的氨基酸位点、活性差异及蛋白质高级结构预测分析,以PmHS2为研究对象,选取9个氨基酸位点进行理性定点突变,获得一系列PmHS2突变体;通过重组蛋白活性分析,发现将476位异亮氨酸突变为苯丙氨酸的突变体（PmHS2-I476F）,将326位苏氨酸突变为丝氨酸的突变体（PmHS2-T326S）和将197位苯丙氨酸突变为酪氨酸的突变体（PmHS2-F197Y）的GlcNAc-T活性分别是野生型PmHS2的4.33,3.73和3.29倍;同时,将344位苏氨酸突变为丝氨酸的突变体（PmHS2-T344S）,将130位丝氨酸突变为苏氨酸的突变体（PmHS2-S130T）和 PmHS2-F197Y 的 GlcA-T 活性分别是野生型 PmHS2 的 3.35,2.97和2.73倍。随后,通过结构模拟与底物分子对接,发现将位于高变区域3（hypervariable region3,HV3）上的 326 位苏氨酸（Threonine326,THR326）和 344 位苏氨酸（Threonine 344,THR344）突变成丝氨酸（Serine,SER）后,活性口袋相较于野生型PmHS2明显增大。结合文献中提及过的HV3与受体底物结合相关这一信息,本论文推测THR 326和THR344的突变是通过影响活性口袋大小和底物结合来影响酶催化活性的,并将THR 326和THR 344作为了重点研究对象。4.PmHS2的分子改造:以高活性突变体PmHS2-T344S为出发蛋白,完成了 THR326位点进行饱和突变得到了两个催化活性提升至野生型PmHS2的1.5倍的突变体,344位为丝氨酸且326位丝氨酸的PmHS2的突变体（PmHS2-344S-326S）和344位为丝氨酸且326位色氨酸的PmHS2的突变体（PmHS2-344S-326S）。同时,基于β-葡萄糖醛酸酶水解GlcA-pNP的高通量筛选方法,对PmHS2的位点THR 326和THR 344进行组合饱和突变,获得26个活性提升的突变体,其中326位为蛋氨酸且344位丝氨酸的PmHS2的突变体（PmHS2-344S-326S）的GlcNAc-T和GlcA-T活性提升至野生型PmHS2的3倍左右;通过对饱和突变实验中得到的突变体的高级结构的分析,发现活性提高的突变体的活性口袋的口径变大,该现象为理性定点突变过程得到的推论“THR 326和THR 344的突变是通过影响活性口袋大小和底物结合来影响酶催化活性的”提供了佐证。