研究背景:外泌体是由不同类型细胞分泌的直径约30-150 nm的细胞外囊泡,电镜下呈一侧凹陷的半球形或杯托样结构。外泌体可以将供体细胞中的蛋白质、脂质、核酸等内容物包裹并传递到其他的受体细胞中,发挥细胞间通讯的作用,进而参与多个生理和病理过程。其形成过程如下:细胞膜内陷形成早期内体,早期内体膜再次内陷,包裹细胞质中的蛋白、脂质、mRNA、microRNA等成分,并脱落到早期内体内部,形成管腔内囊泡(intraluminal vesicles,ILVs),随着ILVs逐渐积累,早期内体成熟为晚期内体,即多泡体(multivesicular bodies,MVBs)。MVBs一方面可以运输并锚定在细胞膜上,与细胞膜融合,将其内的ILVs释放到细胞外,即为外泌体;另一方面可以与溶酶体融合,将其内容物降解,然后被细胞循环利用。关于外泌体形成及分泌的分子机制,目前已有相关报道:内吞体分选复合物相关蛋白(如HRS、Tsg101)、某些脂类(如神经酰胺)、四次跨膜蛋白家族(如CD63、CD81)可以通过调节MVBs的形成而影响外泌体分泌;某些Rab GTP酶(如Rab11、Rab27、Rab35)可以通过影响MVBs的运输及锚定到细胞膜的过程,从而影响外泌体的分泌;另外,可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子结合蛋白受体复合物可以在MVBs锚定到细胞膜之后通过调节脂质双层膜的融合,进而影响外泌体的分泌。肾脑表达蛋白(kidney and brain expressed protein,KIBRA)是一种适配器蛋白,通过与其结合伴侣相互作用,参与很多细胞功能,如突触发生、记忆形成、细胞凋亡等。近年来,越来越多的证据表明,KIBRA与细胞极性和囊泡运输有关。在表皮细胞中,KIBRA可以通过抑制非典型蛋白激酶C(atypical protein kinase C,aPKC)的活性,调节细胞的胞吐作用,KIBRA基因敲除后表皮细胞胞吐作用增强;在神经元内KIBRA可以通过与蛋白激酶Cα相互作用蛋白结合,抑制α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体的GluR2亚基回收到细胞膜;KIBRA还可以通过分选连接蛋白4与动力蛋白轻链1相互作用,调节早期内体的长程转运,进而抑制转铁蛋白受体的降解,促进铁蛋白回收利用;另外,KIBRA可以与aPKC相互作用,影响细胞的定向迁移。虽然目前对KIBRA影响囊泡运输已有较多报道,但是尚无研究证明KIBRA能否影响外泌体的分泌。研究目的:1.探讨KIBRA能否调节外泌体的分泌;2.探讨KIBRA调节外泌体分泌的分子机制。研究方法:1.构建KIBRA敲低及过表达细胞系在哺乳动物体内,KIBRA主要表达在脑和肾脏。因此,体外实验我们选用了小鼠海马神经元细胞系(HT22)和小鼠肾小球细胞系(MPC5)。我们首先通过CRISPR-Cas9和慢病毒感染的方法将这两种细胞系中的KIBRA基因敲低或过表达,并用蛋白免疫印迹(western blot,WB)和实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)方法对细胞的敲低和过表达效率进行了验证。2.分离及检测KIBRA敲低和过表达细胞上清中的外泌体为了研究KIBRA对外泌体分泌的影响,KIBRA敲低和过表达细胞及其各自的对照细胞被培养在含有1 0%去外泌体血清的培养基中,48 h后取细胞上清进行离心:4℃,300 g离心10 min,取上清;4 ℃,2000 g离心10 min,取上清;4℃,10 000 g离心30 min,取上清;上清过0.22 μm滤器,将液体过滤到超速离心管内,用Beckman Type 90Ti转头,4℃,100 000 g离心70 min,弃上清;向超离管内加入1 ml磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS)将沉淀重悬,再次4℃,100 000 g离心70 min,弃上清,得到富含外泌体的沉淀。所得沉淀用PBS重悬用于电镜和NTA检测,或用含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液重悬,用于蛋白浓度测定或WB检测。3.分离及检测KIBRA基因敲除小鼠脑组织及肾组织间隙的外泌体为了进一步在生理条件下研究KIBRA对外泌体分泌的影响,我们首先采用密度梯度离心的方法在野生型(wide-type,WT)小鼠脑组织和肾组织间隙分离了外泌体,按蔗糖密度由低到高,共得到a-g 7个组分,将每个组分的沉淀用细胞裂解液裂解后行WB检测,发现与外泌体相关的蛋白标志物主要分布在组分b-e中,提示经蔗糖密度梯度离心后外泌体主要分布在组分b-e中。为了探讨KIBRA能否影响小鼠脑和肾脏组织间隙外泌体的分泌,我们在KIBRA基因敲除(knockdown,KO)小鼠和同窝、同性别WT小鼠的脑组织和肾组织间隙分离了外泌体,并对组分b-e进行了 WB检测,比较外泌体蛋白标志物的表达水平。4.检测KIBRA影响外泌体分泌的分子机制为了探讨KIBRA影响外泌体分泌的分子机制,我们对KIBRA-KO小鼠和WT小鼠大脑皮层和海马组织进行了蛋白质谱分析,以筛选差异表达基因。关于外泌体合成及分泌机制目前已有大量报道,我们整理了目前已被报道的与外泌体合成或分泌相关的蛋白,并根据蛋白质谱结果进行了统计分析,其中,有统计学意义且蛋白表达差异倍数最大的是Rab27a。为了验证蛋白质谱的结果,我们分别通过组织免疫荧光染色、WB和realtime-PCR方法比较了KIBRA-KO小鼠和WT小鼠各组织内Rab27a蛋白和mRNA的表达水平。5.探讨Rab27a的降解途径为了探讨Rab27a的降解途径,我们用蛋白合成抑制剂放线菌酮(cycloheximide,CHX)处理KIBRA敲低细胞(KIBRA-KD)和对照细胞(Ctrl-KD),同时在培养基中分别加入蛋白酶体抑制剂乳胞素(lactacystin,Lac)或溶酶体抑制剂巴佛洛霉素(bafilomycin,Baf)。WB结果提示,Lac可以抑制Rab27a的降解,而Baf不能抑制Rab27a的降解。另外,我们通过免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)方法检测了 Ctrl-KD 和 KIBRA-KD细胞在用Lac处理前和处理后Rab27a的泛素化水平。随后,我们通过Co-IP和免疫荧光共定位方法检测了 KIBRA和Rab27a是否存在直接的相互作用。6.检测在KIBRA敲低的细胞中过表达Rab27a能否逆转外泌体的分泌为了进一步验证KIBRA影响外泌体分泌是否是通过Rab27a实现的,我们在KIBRA-KD和Ctrl-KD细胞中转染了 DsRed-Rab27a质粒,然后用G418筛选具有新霉素抗性的转化株。将细胞在含有1 0%去外泌体血清的培养基中培养48 h,然后用超速离心方法从等量的转染或未转染DsRed-Rab27a质粒的KIBRA-KD和Ctrl-KD细胞的细胞上清中分离外泌体,进行蛋白浓度测定和WB检测。研究结果:1.KIBRA能够调节HT22细胞和MPC5细胞中外泌体的分泌HT22细胞中KIBRA基因敲减后外泌体沉淀中的外泌体蛋白标志物如Alix、CD63、Tsg101和CD9表达量均显著降低,外泌体粒径分析NTA结果同样提示KIBRA-KD细胞分泌的外泌体明显少于对照细胞。相反,在HT22细胞中过表达KIBRA基因后,与对照细胞相比,外泌体蛋白标志物表达量显著增多。另外,为了在验证KIBRA对外泌体分泌的影响是否具有细胞特异性,我们又在MPC5细胞中敲减了KIBRA基因,与对照细胞相比,KIBRA基因敲减后外泌体分泌显著减少。上述结果提示KIBRA能够在HT22细胞和MPC5细胞中调节外泌体的分泌。2.KIBRA影响HT22细胞中MVBs的形态及数量为进一步探讨KIBRA影响外泌体分泌的可能机制,我们用电镜观察了KIBRA-KD细胞及其对照细胞中ILVs和MVBs的形态和数量。研究发现,尽管KIBRA基因敲减后外泌体分泌减少了,但是细胞内MVBs数量以及MVBs内ILVs的数量反而增多,而MVBs的细胞内分布及ILVs的形态无明显变化,提示KIBRA敲减导致外泌体分泌减少不是由于MVBs合成障碍导致的,而是由于MVBs的运输或MVBs与细胞膜的锚定障碍导致的。3.KIBRA影响小鼠体内外泌体的分泌我们在KIBRA-KO小鼠和同窝、同性别WT小鼠脑组织和肾组织间隙分离了外泌体,并对组分b-e进行了 WB检测,与体外实验结果一致,体内实验提示KIBRA基因敲除后小鼠脑组织和肾组织间隙外泌体分泌减少。另外,我们对KIBRA-KO小鼠和WT小鼠的等体积血清中的外泌体进行了 NTA检测,发现KO小鼠血清中的外泌体仅为WT小鼠血清中外泌体含量的52%(p<0.01),而外泌体的大小无明显变化。结果提示KIBRA基因敲除后小鼠脑组织、肾组织和周围血清中外泌体的分泌均受损。4.KIBRA基因敲除促进Rab27a蛋白降解我们通过免疫荧光染色方法比较了 KIBRA-KO小鼠和WT小鼠大脑皮层和海马的Rab27a蛋白表达水平,结果显示与WT小鼠相比,KO小鼠皮层和海马中Rab27a蛋白水平明显降低。另外,WB结果同样提示KIBRA-KO小鼠大脑皮层、海马、肾脏、肌肉、肝脏中Rab27a蛋白表达水平均比WT小鼠显著降低。Real-time PCR结果提示在KIBRA-KO小鼠的肾脏、肌肉、肝脏中Rab27a的mRNA表达水平无明显变化,而在大脑皮层和海马组织中Rab27a的mRNA表达水平反而较WT小鼠显著增高,推测可能是由于KO小鼠脑内Rab27a过度降解引起的Rab27a在mRNA水平上代偿性增高。因此,KIBRA-KO小鼠体内Rab27a蛋白水平降低不是由于Rab27a合成减少而是由于Rab27a降解增多导致的。5.Rab27a通过与KIBRA相互作用免于被泛素化降解通过给药处理,我们发现蛋白酶体抑制剂Lac可以抑制Rab27a的降解,而溶酶体抑制剂Baf不能抑制Rab27a的降解。另外,通过Co-IP我们发现KIBRA基因敲减后Rab27a泛素化水平增高,而用Lac处理细胞12 h后Rab27a泛素化水平进一步增高,提示蛋白酶体抑制剂可以使Rab27a泛素化水平进一步增高,使其易通过蛋白酶体途径被降解。然后,我们通过Co-IP及细胞免疫荧光染色方法证明KIBRA和Rab27a两者存在直接的相互作用。因此,我们认为Rab27a主要是通过泛素-蛋白酶体途径而非溶酶体途径降解,Rab27a通过与KIBRA相互作用使其免于被泛素化降解,从而调节外泌体的分泌。6.在KIBRA-KD细胞中过表达Rab27a可以逆转外泌体的分泌在KIBRA-KD细胞中转染DsRed-Rab27a质粒后外泌体蛋白浓度较转染空载质粒的对照细胞升高了约1.5倍(p<0.05)。对提取的外泌体进行WB检测,同样发现在KIBRA-KD细胞中过表达Rab27a后外泌体蛋白标志物Alix、Hsc70、Tsg101表达水平较未过表达Rab27a的KIBRA-KD细胞显著升高。提示在HT22细胞中敲低KIBRA基因后外泌体分泌减少,而在KIBRA-KD细胞中过表达Rab27a可以逆转外泌体的分泌。结论:1.KIBRA能够调节HT22细胞系和MPC5细胞系的外泌体分泌;2.KIBRA能够调节小鼠脑组织和肾脏组织间隙的外泌体分泌;3.KIBRA通过与Rab27a相互作用,使Rab27a免于被泛素化降解,进而调节外泌体的分泌。