玉米(Zeamays L.)是重要的农作物之一。但是其生长发育和生产力却受到多种环境胁迫的影响。因此,研究玉米在各种胁迫条件下的应激反应是非常必要的。之前的研究表明,当植物受到外界刺激时,植物体感受刺激信号后会通过一系列的信号转导过程将信号传入核内,然后活化细胞核内的转录因子,从而激活下游抗逆相关基因的转录。在植物抵抗外界刺激过程中,激素ABA起着重要的作用植物激素脱落酸(ABA)在植物应激反应中起关键作用。当植物受到非生物胁迫时,ABA含量增加,并且活化的SnRK2s蛋白激酶磷酸化下游转录因子,从而调节应激相关基因的表达。在分析水分胁迫下玉米初生根和子房组织的转录组数据时发现,一个bZIP转录因子受干旱胁迫诱导而转录本丰度大幅度增加,推测它参与玉米对逆境的响应,被命名为ZmbZIP4。在模式植物中,bZIP转录因子参与调控不同的生物学过程,包括生长发育和胁迫响应,然而玉米ZmbZIP4的功能未见报道。ZmmbZIP4是一个胁迫响应的转录因子基于氨基酸序列的bZIP A亚家族成员的系统发育树分析显示,ZmbZIP4与拟南芥中的AREB1和水稻中的OsbZIP23是同源基因。ZmbZIP4在玉米幼苗和成熟植株中普遍表达,但表达丰度表现出不同器官间的差异。且ZmbZIP4可以被高盐、PEG处理、氧化胁迫(H202)、热胁迫和ABA、IAA等诱导而强烈上调表达,冷胁迫、赤霉素酸(GA)和茉莉酸(JA)对ZmbZIP4的表达也有影响。酵母中的转录激活实验结果显示ZmbZIP4具有转录因子所有的结合和激活活性。因此,ZmbZIP4是一个胁迫响应的转录因子。过表达ZmbZIP4促进玉米根系发育和抗逆性将ZmbZIP4基因转入玉米自交系DH4866中实现过表达,从玉米突变体库获得的材料中分离出2个不同插入位点的zmbzip4纯合突变体,分别对ZmbZIP4过表达株系和突变体进行表型鉴定,发现过表达ZmbZIP4可以促进玉米根系发育和抗逆性,而突变体表现出相反的变化。对营养液培养的玉米植株进行根系性状分析得出,转基因ZmbZIP4过表达植株的初生根、种子根和侧根都长于其野生型(DH4866)对照的,而突变体表型相反。这种根系生物量的主要变化是由于侧根的数量和长度的差异引起的。通过对过表达玉米、突变体分别与其对照自交系的侧根原基数目的比较,显示ZmbZIP4的过表达显著增加了玉米的侧根原基数目。当植株遭受高盐或干旱(渗透胁迫)时,无论在溶液培养还是土壤栽培条件下,转基因ZmbZIP4过表达植株较对照DH4866有显著提高的抗逆性,而zmbzip4突变体则表现出明显降低的抗逆性。测定在正常生长条件和盐胁迫条件下转基因ZmbZIP4过表达植株、突变体及它们野生型对照的叶片和根部的ABA含量,发现转基因ZmbZIP4过表达植株积累了更多的ABA,而突变体的ABA含量降低,表明ZmbZIP4过表达促进了玉米ABA积累。ZmbZIP4调控一些胁迫响应和ABA合成的基因的表达为了解析ZmbZIP4在胁迫响应和生长发育过程中的功能,我们利用转基因技术创制出携带ZnbZIP4-GFP结构的玉米株系,并取三叶期植株进行ChIP-Seq检测,所用抗体为ChIP级的GFP单克隆抗体。通过ChIP-Seq、ChIP-qPCR、酵母单杂筛选和荧光素酶活性分析,鉴定出一些对盐和干旱胁迫响应的基因,包括ZmRD20、ZmRD21、ZmRab18、ZmNHX3、ZmGEA6、ZmNF-YA4 和 ZmLEA2。另外,还鉴定了一些与ABA合成相关的基因,有ZEP/ABA1、MCED、AAO3和LOS5/ABA3基因,其中MCED是ABA合成路径中的关键限速酶基因。对这些基因的启动子元件分析和EMSA检测得出ZmbZIP4可以特异地和顺式作用元件“ACGTG”结合。结果显示这些基因均是ZmbZIP4的靶基因,且启动子区都存在“ACGTG”元件,而且ZmbZIP4正调控它们的表达。ZmbZIP4调控一系列根发育相关基因的表达通过ChIP-Seq、ChIP-qPCR、酵母单杂结果和荧光素酶活性分析,鉴定出一些参与玉米根系发育的一些基因,包括ZmSCR、ZmLRP1、ZmIAA8、ZmIAA14、ZmARF2和ZmARF3,作为ZmbZIP4的候选靶基因。这些基因在拟南芥中的同源基因主要参与根系发育的调控,尤其是侧根形成过程。ZmSCR、ZmLRP1、ZmARF2和ZmARF3在转基因ZmbZIP4过表达玉米中上调表达,而ZmIAA8和ZmIAA14则表现为表达下调;在zmbzip4突变体中,这些基因的表达水平呈相反的趋势。结果表明ZmbZIP4可以通过调控一系列根发育相关基因的表达来控制玉米根系发育。ZmbZIP4通过ABA信号转导途径参与调控下游基因的表达利用ZmbZIP4作为钓饵进行酵母双杂交筛选,得到许多ZmbZIP4的候选互作蛋白,这些蛋白主要参与胁迫响应和糖代谢过程,结合ZmbZIP4的核定位特点和在玉米中的生物学功能,选出了 4个可能与ZmbZIP4互作的蛋白进行了Co-IP 验证,得出 ZmbZIP4 可以与 ZmPYL12、ZmMAPK17、ZmEREB182 和ZmNTF1互作。其中ZmPYL12是ABA受体蛋白,提示ZmbZIP4可能参与ABA信号途径。利用酵母双杂交检测对玉米中的ZmSnRK2s成员和ZmbZIP4进行互作验证,明确了 ZmbZIP4 可与 SnRK2.1、SnRK2.3、SnRK2.6、SnRK2.10、SnRK2.11互作,且 ZmSnRK2.1、ZmSnRK2.3、ZmSnRK2.10 在 ZmbZIP4 过表达株系中显著上调表达。结合 ZmSnRK2.1、ZmSnRK2.3、ZmSnRK2.10 可与 ZmPP2C1、ZmPP2C6相互作用的报道,推测ZmbZIP4参与ABA信号途径,有可能在玉米细胞内ZmbZIP4与ZmSnRKs和ZmPP2Cs形成寡聚体而发挥作用。即ZmbZIP4行使转录因子的功能与其磷酸化状态有关,也可能间接影响ABA信号传递及放大。