肺癌是一种常见恶性肿瘤,发病率高,严重影响人们的生活质量。20世纪80年代以来,肺癌的治疗取得了较大的进展,手术、放疗、化疗和免疫治疗的联合应用,大大提高了患者的5年生存率。但手术、放疗和化疗并发症多、毒副作用大。寻找新的有效、简便、毒副作用小的治疗方法成为医务工作者关注的焦点。目前方兴未艾的基因治疗可能成为很有前景的肿瘤治疗方式之一,RNA干扰属于基因治疗的一种新的方式。RNA干扰(RNA interference RNAi)现象发现于1995年,迅速引起研究者的重视。RNAi是由双链RNA介导的、在转录后水平封闭或沉默相应基因表达的基因阻断技术,其原理是小片段RNA(siRNA)依据碱基互补的原理,特异性地结合癌基因的mRNA,干扰其翻译、转录形成蛋白质的功能,阻抑癌蛋白的生成,抑制癌细胞生长或诱导细胞凋亡,从而达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。RNA干扰已经广泛应用于基因功能和各种肿瘤的治疗的研究中。肿瘤实质上是一种细胞周期调控紊乱性疾病。细胞周期的调控是一个及其复杂的过程,涉及到多因子、在多层次上的作用,在细胞周期调控中正性调控因子和负性调控因子之间的平衡失调将导致细胞周期出现紊乱,而泛素蛋白酶体系统通过对多种类型的短寿命周期调控因子的降解,保持细胞周期运行中正负调控因子之间的平衡,保证细胞周期的顺利运行,在细胞周期调控中发挥重要作用。Skp2属于泛素蛋白酶体系统中F-box蛋白家族中一员,在泛素化降解蛋白质过程中负责对底物蛋白的特异性识别,通过对多种靶蛋白的泛素化降解参与细胞周期调控。S期激酶相关蛋白2(Skp2)是Zhang等人于1995年发现的一种蛋白质,因最初发现它在S期与细胞周期蛋白结合的一种蛋白质,所以命名为S期激酶相关蛋白。Skp2是泛素蛋白连接酶SCFSKP2的特异性识别底物的亚单位,属于F-box的家庭成员。Skp2参与了对细胞周期依赖性激酶抑制因子p27、p21、p57、p130/pRb2、E2F1、cyclin E和hOrc1p等细胞周期因子的泛素化降解过程。Skp2通过促进细胞周期蛋白酶抑制物p27、p21的降解,推动细胞周期从G期向S期转换。研究发现Skp2过表达与肿瘤的发生、发展、预后密切相关,近年来许多研究表明Skp2蛋白在许多恶性肿瘤组织及肿瘤细胞的表达增高,而p27蛋白表达是降低的,两者存在明显的负相关。许多研究都证实Skp2具有癌基因的特性,Skp2的表达水平及活性与淋巴瘤,口腔鳞状细胞癌,胶质母细胞瘤,淋巴瘤,乳房癌,结肠癌,肺癌,胃癌的恶性程度、侵袭性、转移、预后密切相关。Skp2虽与细胞周期密切相关,但它调控细胞增殖以及在肿瘤中的发病机制仍不清楚。通过抑制Skp2表达,研究其对肿瘤细胞生物学活性的影响,了解与细胞周期调控因子之间的关系,对于揭示Skp2在细胞周期中的功能、在肿瘤中的发病机制及作为肿瘤治疗的靶点的可行性都具有重要意义。已有大量研究证实采用siRNA表达载体的方法能达到高效、特异抑制目的基因表达的效果,并且能延长对靶基因的抑制作用时间。因此本研究采用与siRNA表达载体相关的干扰技术,旨在探讨Skp2 siRNA表达载体对肺癌细胞内源性Skp2基因的沉默作用。基于RNA干扰技术原理,构建Skp2 siRNA质粒质粒载体,采用脂质体包裹技术,将构建的Skp2siRNA质粒转染SPC-A-1肺癌细胞系,通过沉默肺癌细胞内Skp2基因的表达,采用不同技术方法检测构建的Skp2 siRNA干扰质粒对肺癌细胞增殖、生长、凋亡的影响,以及对接种的裸鼠肿瘤生长的抑制情况,探讨Skp2siRNA表达载体作为肺癌基因治疗新策略的可行性以及Skp2在肺癌发生、发展中的机制。实验分三部分:第一部分:目的:首先筛选出高表达Skp2基因的肺癌细胞,然后构建Skp2 siRNA真核表达质粒,为Skp2基因功能研究打下实验基础。方法:首先筛选出高表达Skp2基因的肺癌细胞株,作为下一步RNAi基因沉默的研究对象。采用RT-PCR和蛋白质印迹技术检测两株A549、SPC-A-1肺癌细胞株和Hela细胞中内源性Skp2基因及蛋白的表达,筛选出高表达Skp2基因的肺癌细胞株。然后依据RNA干扰原理,采用RNAi-DNA载体技术,以Skp2基因为靶点,设计、构建、筛选靶向Skp2基因的小干扰RNA。根据人Skp2基因序列及二级结构特征,设计合成寡核普酸,将其插入pGenesil质粒载体,构建针对Skp2基因的RNA干涉真核表达载体。电泳法初步筛选正确的重组克隆。DNA测序验证重组克隆插入序列的正确性。用构建好的Skp2 siRNA表达载体脂质体介导下转染高表达Skp2的SPC-A-1肺癌细胞系,荧光镜下检测质粒转染效率,G418筛选出阳性细胞克隆。取稳定建株的克隆细胞,RT-PCR、Western blot检测转染质粒的肺癌细胞内Skp2 mRNA及蛋白水平的变化。结果:RT-PCR、Western blot检测结果表明:SPC-A-1肺癌细胞和Hela细胞高表达Skp2,而A549肺癌细胞未检测到Skp2的表达。酶切电泳分析和DNA测序证实重组质粒Skp2 siRNA构建成功; Skp2 siRNA对内源Skp2基因的表达有明显的抑制作用,明显高于对照组,抑制率达(71.2±5.5%)、(65.3±4.8%);Skp2 siRNA对Skp2蛋白明显抑制作用明显,抑制率达(74.1±6.3%)、(67.2±5.5%),与对照组及阴性质粒对照组比较有统计学意义。结论:SPC-A-1肺癌细胞内高表达Skp2;构建的重组质粒Skp2 siRNA能特异、高效抑制SPC-A-1细胞内源性Skp2基因的表达,为下一步研究siRNA对肺癌细胞生长的影响打下实验基础。第二部分:目的:探讨采用RNAi技术抑制Skp2基因表达后,Skp2 siRNA重组质粒对肺癌细胞生长、增殖的抑制情况,以及对细胞周期信号因子p27、p21的影响。方法:MTT、流式细胞仪检测Skp2 siRNA重组质粒细胞组和对照组SPC-A-1细胞细胞增殖、细胞周期的变化。流式细胞学、TUNEL技术检测细胞凋亡。免疫组化、激光共聚焦、Western blot检测肺癌细胞内p27、p21蛋白的表达改变。RT-PCR检测p27mRNA基因变化。结果:Skp2 siRNA重组质粒转染肺癌SPC-A-1细胞后,细胞生长、增殖明显被抑制,细胞凋亡增多。细胞周期检测结果提示:转染Skp2 siRNA重组质粒的细胞进入S期的比例减少,而阻滞在G0/Gl期细胞比例增加。在转染Skp2 siRNA重组质粒的细胞细胞周期调控因子p27、p21蛋白表达增强,而对照组及阴性质粒转染的肺癌细胞增殖及p27、p21蛋白末见明显改变。结论:Skp2 siRNA重组质粒对肺癌细胞SPC-A-1的增殖有明显抑制作用,并可诱导细胞凋亡增加,抑制细胞内Skp2表达后能上调细胞内细胞周期调控因子p27、p21蛋白的表达。第三部分:目的:为探讨构建的Skp2 siRNA质粒载体对体内肿瘤生长的影响,采用转染Skp2 siRNA质粒肺癌细胞建立肺癌动物模型,观察肿瘤生长情况。方法:以BALB/c裸鼠为研究对象,采用皮下注射转染Skp2 siRNA质粒的SPC-A-1细胞和对照组细胞悬液,建立肺癌细胞的裸鼠动物模型:通过观察肿瘤形成时间,测量肿瘤体积和重量方法观察肿瘤形成和肿瘤的生长状况;采用免疫组织化学染色、Western blot检测肿瘤组织Skp2蛋白的表达。结果:转染Skp2 siRNA质粒的肺癌细胞接种裸鼠皮下后,肿瘤生长明显减慢。与对照组相比,转染Skp2 siRNA质粒组肿瘤体积明显缩小,Skp2蛋白下调(73.5±4.2%)、(67.3±3.2%),而肿瘤内细胞周期调控因子p27、p21蛋白表达均明显上调。结论:RNAi技术沉默Skp2蛋白表达后,Skp2 siRNA明显抑制了体内肿瘤的生长,上调p27、p21蛋白的表达。Skp2有望成为肺癌基因治疗的靶点。