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背景:乙肝病毒(HBV)感染是全球严重的公共卫生问题之一,全球60亿人口中约有20亿人感染过HBV,其中慢性HBV感染约有2.57亿人,约占全球人口的4%。由于HBV逆转录酶缺乏校正功能,在宿主免疫压力和抗病毒药物的作用下,病毒本身会不断发生变异、进化,形成新的基因型。目前HBV共可分为A-J10个基因型,每个基因型又可分为多个亚型,随着HBV研究的进一步深入,越来越多的基因型和亚型陆续被发现。同时经生物信息学的不断发展,不同基因型间的重组毒株相继被发现。广西是我国乙肝病毒流行率较高的地区,该地区HBV基因分型相对复杂,其中B型和C型较为常见,基因型I(重组型)在一些地区的流行率也较高。2011年,本课题组研究发现:在广西那坡县863名HBsAg携带者中,有6名利用HBV S区基因序列进行基因分型时无法分型或者两次分型结果不一致,提示该地区可能存在未知基因型的HBV或者重组型毒株。目的:对在广西那坡县发现的未能分型HBV毒株进行全基因组测序和生物信息学分析,确定其基因分型,分析毒株的基因序列特征。方法:查找2011年采集的血清标本及其基本信息,并与当地疾控中心联系,在征集乙肝病毒携带者同意后,于2018年再次采集其血清标本。利用酶联免疫吸附测定(ELISA法)对乙肝病毒血清标志物进行定性检测,采用PCR荧光探针法检测乙肝病毒载量,采用酚、氯仿法提取乙肝病毒核酸,使用巢式PCR扩增HBV全长基因,并将PCR扩增产物进行克隆和测序,使用Sequencher 5.1软件对测序结果进行拼接整理,在NCBI GenBank中检索涵盖A-I的9个基因型的HBV全基因组序列作为参考序列,利用Mega6.0、Bioedit 7.2.6、RDP4等软件对所获得的序列进行生物信息学分析。结果:(1)基本情况:通过查找2011年采集的血液标本以及2018年新采血液样本,收集了6例乙肝病毒携带者共11份血液样本,其中8份标本经PCR扩增、基因测序获得相应的全基因组序列,3份在经PCR扩增全基因组序列时失败,未能获得全基因组序列。(2)NP137病毒携带者:此携带者有2011及2018年采集的两份血清标本,分别为NP137Q和NP137,后者HBV-DNA载量为567.71IU/mL。两份标本的血清学检测结果相同:HBsAg阳性、HBsAb阴性、HBeAg阴性、HBeAb阳性和HBcAb阳性。通过对PCR产物克隆,每份标本分别挑取15个阳性克隆株,全部获得完整的全基因组序列。对获得的全基因组序列进行生物信息学分析发现:该携带者2011年感染的病毒基因型为B型(3株)、D型(8株)以及未知基因型(4株);2018年感染的病毒基因型仅为D型(15株)。30个克隆株中有23株(2011年8株,2018年15株)单独聚集成簇,且不与D基因型的其他亚型成簇,Bootstrap值为100%。与D1-D10各亚型间的核苷酸差异>4%,提示这是新的基因亚型,因此,将该新基因亚型命名为D11亚型。与其他D基因亚型毒株相比,共发现37个氨基酸为新亚型毒株所特有,其中15个氨基酸在新亚型毒株中均含有。23株新亚型毒株血清型均为ayw2,15株在preC区1896位出现由G到A的突变,导致终止密码子的产生。在所有的毒株中均未有A1762T/G1764A双突变以及C1766T突变和T1768A突变。然而,23个毒株中有18个存在T1753C突变。2011年标本获得的15条克隆株中有3株毒株为B2亚型,4株毒株为B/D重组毒株,其重组亲本为B2亚型和D11亚型毒株。B2亚型以及其中3株重组毒株的血清型为adw2,NP137Q-20毒株的血清型为adw。(3)NP911病毒携带者:此携带者有2011及2018年采集的两份血清标本,分别为NP911Q和NP911,标本NP911Q血清学检测结果:HBsAg阳性、HBsAb阳性、HBeAg阴性、HBeAb阳性和HBcAb阳性。标本NP911血清学检测结果:HBsAg阳性、HBsAb阴性、HBeAg阴性、HBeAb阳性和HBcAb阳性,HBV-DNA载量为3.23?10~7IU/mL。通过对PCR产物克隆,样本NP911共得到10个克隆株,全部获得完整的HBV全基因序列。NP911Q因在巢式PCR扩增时失败,未能获得该样本的全长基因序列。对标本NP911获得的克隆株进行生物信息学分析发现:10株克隆毒株均存在缺失突变,基因型为I1,前C区存在G1896A突变,10株克隆株均为A1762T/G1764A BCP双突变毒株。(4)NP808、NP872和NP634病毒携带者:前两者有2011及2018年采集的两份血清标本,后者仅有2011年采的标本,它们分别为NP808、NP808Q、NP872、NP872Q和NP634Q病毒携带者,他们感染的乙肝病毒均为C1基因亚型,HBsAg阳性,血清型均为adrq~+。未发现G1896A突变及A1762T/G1764A BCP双突变。(5)NP422病毒携带者:有2011及2018年采集的两份血清标本,分别为NP422Q和NP422,但在全基因组PCR扩增时失败,未获得全基因组序列。结论:(1)感染研究对象NP137的部分乙肝病毒株属于新的基因亚型,命名为D11亚型。(2)感染研究对象NP137的部分乙肝病毒株属于新的重组型毒株:B/D重组毒株。(3)当乙肝病毒携带者体内存在不同基因型HBV混合感染时,将PCR产物直接进行测序,用获得的序列进行基因分型,结果不可靠,需用克隆测序获得的序列进行分型。(4)当乙肝病毒携带者体内存在不同基因型HBV混合感染时,因病毒复制存在消长现象,在不同时间点检测病毒基因型,会出现分型结果不一致的现象。(5)当存在基因重组或使用S基因序列不能确定病毒基因型时,要通过全基因组序列进行分型。