癌症是全球主要的公共卫生问题。全球人口统计学特征预测,到2025年,每年预计将有超过2000万新增癌症病例。目前,临床上使用的化疗药具有疗效差,副作用多、毒性大等缺点。此外,开发新的抗肿瘤药需要很长时间,并且需要大量资源。在中药中提取有效成分或者发现和开发新颖的天然化合物以及组合配方,具有选择性优先杀死癌细胞并抑制癌症的扩增而无明显毒性的优势,这是癌症治疗的重要手段之一。壁虎是一种爬行动物,在中国已被广泛用作治疗包括癌症在内的各种疾病,是中国传统中药。已经证明,从壁虎提取的壁虎多肽混合物（Gecko peptide mixture GPM）可以抑制多种类型肿瘤细胞的生长。本研究的目的是采用水提醇沉和超滤技术从壁虎中分离出活性组分,初步探讨其抗肿瘤机制并分析其主要成分,为壁虎天然组分的研发和进一步的临床实践应用提供实验和理论依据。第一部分:壁虎活性组分提取及目标组分的选定目的:通过水提醇沉、超滤等方法从壁虎中分离出特定分子量大小的活性相对最好的组分。方法:选用干燥多疣壁虎,在中药打粉机中打磨至细粉后经胶体磨研磨匀浆,离心后取下层沉淀加入55%乙醇提取,再次离心后收集上清液,经过旋转蒸发浓缩,冷冻干燥后得到金黄色的壁虎醇提物;将壁虎醇提物用截留量为3000 Da超滤管截留,截留条件为:5500 rpm/min,离心30 min,每一次收集下层滤液合并为下层3000^-Da组分,多次过滤直至下层没有滤液收集上层组分得到上层3000⁺Da组分。在课题组前期工作的基础上,采用MTT法比较上下两层活性,所得组分以抑制人食管癌EC9706细胞、人前列腺癌DU145细胞、人黑色素瘤B16F10细胞、人肝癌HepG2细胞增殖情况为作为活性筛选指标。结果:经过噻唑蓝溴化四唑（MTT）法检测超滤管截留的上下两组分活性,结果显示上、下两层组分24 h、48 h均可显著抑制EC9706、DU145、B16F10、HepG2细胞的增殖,上层组分对Ec9706细胞24 h、48 h的IC50值为（0.26±0.04）、（0.23±0.03）mg·m L^-1,对DU145细胞24 h、48 h的IC50值为（0.29±0.04）、（0.26±0.07）mg·m L^-1,对B16F10细胞24 h、48 h的IC50值为（0.30±0.02）、（0.25±0.04）mg·m L^-1,对HepG2细胞24 h、48 h的IC50值为（0.19±0.03）、（0.17±0.05）mg·m L^-1;下层组分对Ec 9706细胞24 h、48 h的IC50值为（0.31±0.05）、（0.28±0.04）mg·m L^-1,对DU145细胞24 h、48 h的IC50值为（0.37±0.05）、（0.30±0.04）mg·m L^-1,对B16F10细胞24 h、48 h的IC50值为（0.36±0.03）、（0.33±0.04）mg·m L^-1,对HepG2细胞24 h、48 h的IC50值为（0.35±0.05）、（0.32±0.02）mg·m L^-1,由结果看出,上层组分较下层组分抑制作用更强,差异有统计学意义,且上层组分对肝癌HepG2细胞作用最强,24 h、48 h的IC50值为（0.19±0.03）、（0.17±0.05）mg·m L^-1。结论:中药壁虎经过水提醇沉,超滤等步骤得到上层超滤组分和下层超滤组分。经过对两种组分的活性研究,壁虎上层超滤组分活性较好。第二部分:壁虎超滤组分通过Hippo信号通路对人肝癌HepG2细胞作用的研究目的:以人肝癌HepG2细胞为研究对象,探讨壁虎超滤组分对人肝癌HepG2细胞生长的影响;探讨Hippo信号通路在壁虎超滤组分抑制人肝癌HepG2细胞中的作用。方法:将实验分为对照组（无药物组）、实验组（壁虎超滤组分低、中、高浓度组）:使用EdU法检测人肝癌HepG2细胞增殖能力;划痕愈合实验、Transwell小室迁移和Matrigel侵袭实验检测人肝癌HepG2细胞迁移侵袭能力;流式细胞术检测人肝癌HepG2细胞早期凋亡情况;Western Blot实验检测人肝癌HepG2细胞内蛋白水平变化。检测指标有:血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF）、Rac家族小GTPase 1（Rac Family Small GTPase 1,Rac-1）、E-钙黏蛋白（E-cadherin）、Bax、Bcl-2、大肿瘤抑制激酶1（Large Tumor Suppressor Kinase1,LATS1）、哺乳动物STE20-like蛋白激酶1（Mammalian STE20-Like Protein Kinase 1,MST1）、Yes相关蛋白1（Yes Associated Protein,YAP1）、p-YAP1等蛋白。结果:EdU法实验结果显示,实验组与对照组相比,随着药物浓度的增大,细胞棕色染色越来越淡细胞棕色染色数量逐渐减少,细胞增殖能力下降。差异有统计学意义。划痕愈合实验表明,壁虎超滤组分作用于人肝癌HepG2细胞24 h后,实验组划痕面积明显减少,对照组划痕面积变化不大。对照组和低、中、高浓度实验组划痕面积愈合率分别为:（71.88±6.95）%、（60.65±4.81）%、（42.56±3.97）%、（26.86±3.11）%,说明低、中、高浓度实验组均能抑制肝癌细胞的愈合能力,随着药物浓度的增加,抑制作用更强,差异有统计学意义。Transwell小室迁移实验结果显示,与对照组比较,实验组肝癌细胞穿透个数减少,各组细胞穿透数量为:对照组（159.67±12.09）个、低浓度实验组（127.33±8.58）个、中浓度实验组（88.67±7.34）个、高浓度实验组（61.67±15.45）个,差异有统计学意义。药物浓度越高效果越明显。Matrigel侵袭实验中,实验组穿透细胞个数均比对照组少,高浓度组数量减少明显,各组细胞穿透数量为:对照组（140.33±23.98）个、低浓度实验组（107.67±10.95）个、中浓度实验组（80.33±10.00）个、高浓度实验组（48.33±12.89）个,差异有统计学意义。Western blot实验中,肝癌细胞内与对照组相比,实验组VEGF与Rac-1蛋白表达降低,E-cadherin蛋白表达升高。对照组和低、中、高浓度实验组的VEGF蛋白与GAPD的灰度比值为:0.91±0.01,0.85±0.01,0.71±0.01,0.58±0.02;这四组的Rac-1蛋白与GAPDH的灰度比值为:0.89±0.01,0.76±0.01,0.52±0.01,0.27±0.01;这四组的E-cadherin蛋白与GAPDH的灰度比值为:0.46±0.01,0.66±0.01,0.86±0.01,0.93±0.01,差异有统计学意义。E-cadherin表达增高会增加肿瘤细胞之间的粘附性,VEGF表达降低可以减少肿瘤血管的生成,Rac1在细胞迁移过程中发挥着重要作用。以上因子的变化可以看出,壁虎超滤组分能够使肝癌细胞减少迁移与侵袭,与划痕愈合实验以及Transwell迁移侵袭实验结果一致。流式细胞实验中,从人肝癌HepG2细胞凋亡检测结果发现,实验组对比对照组的早期凋亡率均有所提高,这种差异在高药物浓度组更明显,差异有统计学意义。在Western blot实验中,通过对人肝癌HepG2细胞内Bax、Bcl-2等蛋白的检测可以看出,与对照组相比,随着实验组药物浓度的增加,Bax/Bcl-2的比值随之增大,诱导肝癌细胞的凋亡的作用越强。对照组和低、中、高浓度实验组的Bax蛋白与GAPDH灰度比值为:0.94±0.01,0.79±0.06,0.72±0.01,0.46±0.01;这四组的Bcl-2蛋白与GAPDH的灰度比值为:0.46±0.01,0.54±0.01,0.81±0.01,0.95±0.01,差异有统计学意义。与流式细胞术检测结果一致。Western blot实验结果显示,与对照组相比,实验组LATS1、MST1、p-YAP1等蛋白表达均有不同程度的提高,YAP1蛋白的表达下降,随着药物浓度的提高相应趋势更明显,对照组、低浓度实验组、中浓度实验组、高浓度实验组等四组YAP1的蛋白与GAPDH的灰度比值为:0.95±0.09,0.84±0.02,0.69±0.08,0.56±0.06;p-YAP1、MST1、LATS1蛋白表达水平升高。这四组的p-YAP1蛋白与GAPDH的灰度比值为:0.22±0.01,0.39±0.01,0.49±0.01,0.69±0.02;这四组MST1蛋白与GAPDH灰度比值为:0.28±0.03,0.37±0.01,0.49±0.07,0.62±0.08;这四组LATS1蛋白与GAPDH的灰度比值为:0.41±0.02,0.56±0.08,0.77±0.08,0.87±0.01,差异有统计学意义。结论:上层超滤组分对肝癌HepG2细胞的增殖与迁移有明显的抑制作用,对肝癌HepG2细胞的凋亡有促进作用,可能是与超滤组分作为一种细胞生长抑制信号激活Hippo通路后,引起通路下游核心因子YAP磷酸化有关。