一、研究背景前列腺癌(prostate cancer, CaP)是一种老年男性常见病,其发病率在美国居男性恶性肿瘤之首,占男性死亡原因的第二位。自1941年Huggins等采用雄激素剥夺疗法治疗晚期前列腺癌取得显著疗效后,激素治疗逐渐成为治疗前列腺癌的一项重要的方法。内分泌治疗对大多数CaP有明显的疗效但有其局限性,一般仅能维持6～18个月,几乎所有CaP患者最终均转为雄激素非依赖前列腺癌(androgen- independent prostate cancer, AIPC),进而发展为激素难治性前列腺癌(hormone refractory prostate cancer, HRPC)。目前对HRPC缺乏有效的治疗方法,放疗、化疗、生物治疗等均不能有效地控制肿瘤进展,其平均生存期为9～18个月。目前临床对激素非依赖前列腺癌发病机制主要集中在细胞的克隆学说、肿瘤基因的激活或融合、抑癌基因的失活、抗凋亡基因的上调、雄激素的共刺激因子激活、雄激素受体的突变或超敏和前列腺组织雄激素合成等多个方面。虽然有关CaP雄激素依赖进展的研究及学说很多,但雄激素非依赖的发生机制至今尚不完全清楚。翻译后的蛋白质修饰在生物体的功能上起关键作用,而可逆的磷酸化几乎调节着细胞信号传导、细胞分化、细胞生长、细胞凋亡等几乎所有的生命活动。在前列腺癌内分泌治疗过程中非激素依赖转化过程成中,蛋白质的磷酸化也发挥重要的作用。二、研究目的利用蛋白组学技术和生物信息学研究激素依赖前列腺癌细胞转化为激素非依赖前列腺癌细胞过程中差异磷酸化蛋白的表达,从整体水平探索磷酸化蛋白质的作用模式、功能调节以及蛋白质群内相互作用,揭示可能介导转化过程的信号通路,有助于为更全面的了解前列腺癌非激素依赖转化的机制,为其治疗提供新的治疗靶点。三、实验方法(一)、培养人激素依赖性前列腺癌细胞株(LNCaP),并通过除去培养基中的雄激素诱导建立起激素非依赖性前列腺癌细胞株(LNCaP-AI),通过CCK-8法验证LNCaP-AI在去雄环境下的增值能力以及测定在不同雄激素浓度下分泌PSA的情况。(二)、分别提取LNCaP细胞和LNCaP-AI的总蛋白,采用固定金属螯合亲和层析(immobilized metal affinity chromatography, IMAC)富集两种细胞的磷酸化蛋白,并分离纯化,利用二维凝胶电泳技术分离两种细胞磷酸化蛋白质组样品,获得满意的两种细胞株的磷酸化蛋白双向凝胶电泳图谱,凝胶经银染显色后,PSQuest分析软件进行比较分析,筛选出差异3倍以上的且超过半数胶中均存在的蛋白点。将差异点从胶中切出,进行胶内酶解,得到肽段混合物。应用基质辅助的激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)与串联质谱(MS/MS)方法对差异点进行磷酸化蛋白质鉴定。使用Mascot查询软件搜索SWISS-PROT以及NCBInr数据库做生物信息学分析。(三)、从2-DE筛选出的差异磷酸化蛋白中挑选了Peroxiredoxin-2和HSP27两种蛋白,应用western blot的方法进行验证。(四)、运用STRING数据库和软件对LNCaP-AI中所有的、上调的、下调的鉴定的磷酸化蛋白质进行一级相互作用预测,探讨其在信号通路中的作用。四、结果(一)、LNCaP前列腺癌细胞在去激素的环境下生长迅速受到抑制,一周左右开始处于自分泌状态,1个月后逐渐适应了去雄激素的环境,6个月后能够正常增殖和传代,成为激素非依赖的LNCaP-AI细胞亚系,其PSA分泌水平随雄激素水平的增高而增加,但表达PSA的水平要低于LNCaP细胞。(二)、采用磷酸化富集及二维凝胶电泳分离LNCaP细胞和LNCaP-AI细胞磷酸化蛋白质组样品,凝胶经银染显色后,PDQuest 7.1.0软件进行比较分析。共发现28个点差异在3倍以上,其中有13个点在LNCaP-AI细胞组表达上调,15个点在LNCaP细胞对照组表达上调。(三)、应用MALDI-TOF-MS质谱技术(Voyager-DE STR质谱仪,美国Applied Biosystems公司)对差异蛋白质点进行鉴定,用Mascot数据库。共鉴定出包括核磷蛋白(Nucleophosmin)、热休克蛋白β1(Heat shock protein beta-1, HSP27)、过氧化物还原酶2和6(Peroxiredoxin-2和Peroxiredoxin-6)等参与信号转导、细胞骨架调节、能量代谢等有关的17种蛋白质。(四)、应用Western-blot的方法对包括Peroxiredoxin-2 ,Heat shock protein beta-1在内的2种蛋白进行了验证,蛋白变化趋势与质谱鉴定结果一致。(五)、应用STRING数据库和文献支持分析,认为P53与HSP27的相互作用及MAPK信号通路、抗氧化蛋白活性的减低在激素非依赖前列腺癌转化过程中发挥重要作用,因此阻断MAPK信号通路或提高过氧化物还原酶活性可以提供一种新的治疗前列腺癌方法。五、结论LNCaP-AI细胞系是从LNCaP细胞系经过去雄激素干预后建立的细胞亚系,可以模拟临床上内分泌治疗过程中,前列腺癌由激素依赖发展为雄激素非依赖的过程,并且两者细胞具有同源性,两者有可比性,可以用来观察前列腺癌由激素依赖向非依赖转变过程的分子生物学变化。通过磷酸化蛋白富集策略,比较蛋白质组学和生物信息学,成功鉴定了包括信号转导蛋白、细胞骨架蛋白、能量代谢相关蛋白等17种在激素非依赖前列腺癌中差异表达的磷酸化蛋白。生物信息学分析认为P53与HSP27的相互作用及MAPK信号通路、抗氧化蛋白活性的减低在激素非依赖前列腺癌转化过程中发挥重要作用,因此阻断MAPK信号通路和提高过氧化物还原酶活性可提供一种新的治疗前列腺癌方法。