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动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是多种心脑血管疾病的主要病理基础,是一种以粥样斑块为显著特征的慢性病理过程,属中医学“痰”、“瘀”的范畴。艾灸疗法以其温阳通脉,活血化瘀的特性在防治AS方面具有独特的优势。现代研究证明,艾灸可以通过改善脂质代谢、炎症反应、氧化应激、血小板活化以及内皮细胞功能多个途径,起到多靶点治疗AS的作用。艾烟是艾灸起效的重要因素之一,课题组前期研究也证明了艾烟在抗AS中的作用。Rho/ROCK信号通路在人体内广泛分布,该通路的异常激活可以活化血小板,损伤内皮功能,促使巨噬细胞泡沫化,抑制胆固醇逆向转运途径,加重炎症反应和氧化应激,与AS的各项发病机制均有深入的联系,也是近年来抗AS治疗中新的靶点和焦点。课题组前期研究发现,艾灸对胆固醇逆向转运途径及炎症反应展现出确切的改善作用。因此,开展艾灸干预Rho/ROCK信号通路的研究,一方面是对课题组前期成果的进一步深化;另一方面,对于揭示艾灸防治AS的机制,有着较大的意义。基于上述基础,我们提出假说,艾灸及艾烟可能通过调节Rho/ROCK信号通路,发挥调节脂质代谢及胆固醇逆向转运途径、缓解炎症反应的作用,来实现防治AS的作用。目的:观察艾灸及艾烟对ApoE-/-小鼠脂质代谢、胸主动脉病理等AS常规指标的作用,通过对比阳性药物辛伐他汀以验证艾灸及艾烟抗AS的效应。以Rho/ROCK信号通路作为切入点,通过对比ROCK抑制剂法舒地尔探讨艾灸及艾烟改善AS的可能作用机制。方法:在前两章实验中,将60只8周龄雄性ApoE-/-小鼠随机分为4组:模型组、艾灸组、艾烟组和辛伐他汀组各15只,以高脂饲料喂养。15只8周龄雄性C57BL/6非转基因小鼠作为空白对照组,以普通饲料喂养。空白组和模型组小鼠均采用固定器固定,每日抓取固定20 min;艾灸组采用固定器固定小鼠,在膻中穴施灸20min;艾烟组采用固定器固定小鼠后,将固定器放入5-15mg/m3的艾烟环境中20 min;辛伐他汀组小鼠每日每只按2.8 mg/kg的剂量给药,各组每周均干预6天。连续干预14周后取材,采用生化法检测血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C脂代谢相关指标含量,ELISA法检测血清ApoA1、ox-LDL等脂蛋白水平;HE染色和油红“O”染色从横向和纵向观察胸主动脉的斑块病理变化及结构改变。在后两章实验中,药物组选用法舒地尔,其余小鼠品系、饲养、分组、干预情况与前两章一致。免疫组化法、Western blot法和RT-PCR法检测胸主动脉Rho、ROCK2、PPARγ、LXRα和ABCA1的阳性面积比、蛋白表达水平和mRNA表达量;ELISA法检测TGF-β1、IL-6、IL-10和IL-17等炎症因子水平。结果:1.血脂及脂蛋白模型组小鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C和ox-LDL含量显著高于空白组(P<0.01),ApoA1含量显著低于空白组(P<0.01);艾灸组小鼠血清中TC含量与模型组相比显著降低(P<0.01),TG、LDL-C和ox-LDL含量下降(P<0.05),HDL-C含量显著升高(P<0.01),ApoA1含量上升(P<0.05);艾烟组小鼠血清中TC、LDL-C和ox-LDL含量与模型组相比显著降低(P<0.01),TG含量下降但无统计学差异(P>0.05),HDL-C含量上升(P<0.05),ApoA1含量显著升高(P<0.01);辛伐他汀组小鼠血清中TC、TG、LDL-C含量与模型组相比显著降低(P<0.01),ox-LDL含量下降但无统计学差异(P>0.05),HDL-C含量上升但无统计学差异(P>0.05),ApoA1含量明显升高(P<0.01)。2.胸主动脉病理观察HE和油红“O”染色结果显示,模型组动脉粥样斑块病变最为严重,主动脉管腔狭窄,斑块内可见泡沫细胞、炎性细胞浸润以及胆固醇结晶,血管中膜向内膜增生。艾灸组和辛伐他汀组病理改善显著,动脉粥样斑块与模型组相比面积较小,炎性细胞浸润较少,血管中膜平滑肌增生程度较轻,两组组间差异不明显。艾烟组小鼠主动脉管腔狭窄,可见动脉粥样斑块,斑块内可见泡沫细胞和炎性细胞浸润,程度较模型组轻,血管内膜结构破坏,血管中膜增生。3.Rho/ROCK信号通路免疫组化结果显示,模型组小鼠主动脉Rho、ROCK2表达和阳性面积与空白组相比增加,差异有显著统计学意义(P<0.01);与模型组相比,艾灸组、艾烟组和法舒地尔组Rho、ROCK2表达和阳性面积减少,差异有显著统计学意义(P<0.01)。Western blot结果显示,模型组小鼠主动脉Rho、ROCK2蛋白表达量较空白组升高,差异有显著统计学意义(P<0.01);与模型组相比,艾灸组、艾烟组和法舒地尔组小鼠主动脉Rho、ROCK2蛋白表达量降低,差异有显著统计学意义(P<0.01)。RT-PCR结果显示,模型组小鼠主动脉Rho、ROCK2的mRNA表达较空白组升高,差异有显著统计学意义(P<0.01);与模型组相比,艾灸组、艾烟组和法舒地尔组小鼠主动脉Rho、ROCK2的mRNA表达降低,差异有显著统计学意义(P<0.01)。4.胆固醇逆向转运及炎症因子免疫组化结果显示,模型组小鼠主动脉PPARγ表达和阳性面积与空白组相比减少(P<0.05)、LXRα显著减少(P<0.01),ABCA1减少但无统计学差异(P>0.05);与模型组相比,艾灸组、艾烟组和法舒地尔组PPARγ、LXRα表达和阳性面积显著增加(P<0.01),ABCA1增加但无统计学差异(P>0.05)。Western blot结果显示,模型组小鼠主动脉PPARy和LXRα蛋白含量较空白组明显降低(P<0.01),ABCA1蛋白表达量较空白组明显升高(P<0.01);与模型组相比,艾灸组、艾烟组和法舒地尔组小鼠主动脉PPARγ和LXRα蛋白表达量显著升高(P<0.01),艾灸组、艾烟组和法舒地尔组小鼠主动脉LXRα蛋白表达量显著升高(P<0.01)。艾灸组和法舒地尔组小鼠主动脉ABCA1蛋白表达量显著降低(P<0.01),而艾烟组无统计学差异(P>0.05)。RT-PCR结果显示,模型组小鼠主动脉PPARγ、LXRα、ABCA1的mRNA表达量较空白组明显降低(P<0.01);与模型组相比,艾灸组、艾烟组和法舒地尔组小鼠主动脉PPARy、LXRα、ABCA1 的 mRNA 表达量显著升高(P<0.01)。模型组小鼠血清TGF-β1含量低于空白组(P<0.05),IL-10含量显著低于空白组(P<0.01),IL-6、IL-17含量显著高于空白组(P<0.01,P<0.05);艾灸组小鼠血清中TGF-β1和IL-10含量与模型组相比显著升高(P<0.01),IL-6和IL-17含量与模型组相比下降(P<0.05);艾烟组小鼠血清中TGF-β1和IL-10含量与模型组相比上升(P<0.05),IL-6含量与模型组相比显著降低(P<0.01),IL-17含量下降但无统计学差异(P>0.05);法舒地尔组小鼠血清中TGF-β1和IL-10含量与模型组相比显著升高(P<0.01),IL-6含量与模型组相比下降(P<0.05),IL-17含量与模型组相比显著降低(P<0.01)。结论:1.艾灸及艾烟均可通过调节脂代谢紊乱、改善主动脉动脉粥样病理状况,从而减缓AS发生发展。2.艾灸及艾烟可下调Rho/ROCK信号通路相关指标的蛋白和mRNA表达。3.艾灸及艾烟可上调胆固醇逆转运途径相关指标,可双向调节炎症因子水平,以减缓AS病理进程。4.艾灸及艾烟调节胆固醇逆向转运途径和炎症反应的作用机制,可能与其调控Rho/ROCK信号通路有关。