哺乳动物卵母细胞的冷冻保存是生命科学领域的重要研究内容之一,近年来,尽管人们对此进行了大量的研究,但卵母细胞冷冻保存的效果仍不理想,尤其是未成熟卵母细胞的冷冻效果更差。影响卵母细胞玻璃化冷冻效果的因素很多,其中降温速率被认为是最重要的影响因素。目前,卵母细胞玻璃化冷冻主要采用液氮(-196℃)为冷源,而液氦的温度可以达到-269℃,本课题拟在液氮OPS玻璃化冷冻的基础上,尝试以温度更低的液氦为冷源,通过加快降温速率来改进牛未成熟卵母细胞的冷冻效果,建立并优化牛未成熟卵母细胞的液氦玻璃化冷冻方法。1.牛未成熟卵母细胞液氮OPS玻璃化冷冻方法的建立试验1:OPS管拉制方法研究。分别以水浴锅、普通酒精灯和自制小酒精灯为热源,探究OPS管的拉制方法。结果表明,水浴锅和普通酒精灯均无法拉制出符合要求的OPS管,只有自制小酒精灯可以拉制出内径和管壁厚度分别为0.8mm和0.07 mm左右的OPS管。试验2:细管法和OPS玻璃化冷冻法的对比。将采集到的COCs随机分为3组,对照组、细管组和OPS组。对照组不经冷冻直接进行IVM、IVF和早期胚胎IVC。两个冷冻组分别用细管法和OPS法进行玻璃化冷冻,解冻后分别进行IVM、IVF和早期胚胎IVC。结果显示:与对照组卵母细胞的形态正常率、成熟率、卵裂率和囊胚率(100%、86.1%、69.7%和38.2%)相比,两冷冻组的各项指标均显著降低(P<0.05)。在两个冷冻组中,细管组和OPS组卵母细胞的形态正常率分别为65.2%和77.8%,成熟率分别为31.0%和41.6%,卵裂率分别为19.9%和29.8%,囊胚率分别为0和7.0%。OPS组上述指标均明显高于细管组(P<0.05)。结论:用自制小酒精灯更易于拉制出适于玻璃化冷冻的OPS管;液氮OPS法玻璃化冷冻牛未成熟卵母细胞的效果优于细管法。2.牛未成熟卵母细胞液氦OPS玻璃化冷冻方法的探索将采集到的COCs随机分为3组,对照组、液氮组和液氦组。对照组不经冷冻直接进行IVM、IVF和早期胚胎IVC。两个冷冻组分别以液氮和液氦为冷源,以OPS管为载体对牛未成熟卵母细胞进行玻璃化冷冻,解冻后分别进行IVM、IVF和早期胚胎IVC。结果显示:与对照组卵母细胞的形态正常率、成熟率、卵裂率和囊胚率(100%、87.0%、69.5%和42.0%)相比,两冷冻组的各项指标均显著降低(P<0.05)。在两个冷冻组中,液氦组解冻后卵母细胞的形态正常率(84.7%)显著高于液氮组(78.5%;P<0.05)。经过体外成熟后,液氦组卵母细胞的成熟率(43.9%)显著高于液氮组(39.2%;P<0.05)。经过体外受精和早期胚胎体外培养后,液氦组的卵裂率和囊胚率(35.4%和6.4%)显著高于液氮组(30.0%和4.1%;P<0.05)。结论:液氦OPS玻璃化冷冻法的效果优于液氮法;液氦作为冷源冷冻保存牛未成熟卵母细胞是可行的。3.液氦OPS玻璃化冷冻方法的优化试验试验1:最佳冷冻保护液的筛选。将采集到的COCs随机分为6组,其中一组不经冷冻,作为对照组,其余五组分别使用五种浓度的冷冻保护液(EDS30、EDS35、EDS40、EDS45和EDS50)进行液氦OPS法玻璃化冷冻,解冻后分别进行IVM、IVF和早期胚胎IVC。结果显示:与对照卵母细胞的形态正常率、成熟率、卵裂率和囊胚率(100%、84.5%、69.9%和41.1%)相比,所有冷冻组的各项指标均显著降低(P<0.05)。在五个冷冻组中,EDS35组卵母细胞(90.3%、51.9%、41.8%和10.0%)冷冻-解冻后的冷冻效果均显著高于其他四组(P<0.05)。EDS50组(75.1%、36.0%、27.2%和2.6%)的冷冻效果最差,显著低于其他四组(P<0.05)。EDS30(83.0%、42.0%、33.8%和6.5%)、EDS40(84.9%、43.9%、34.9%和6.4%)、EDS45(82.6%、42.4%、33.2%和5.1%)组之间的差异均不显著(P﹥0.05)。试验2:液氦玻璃化冷冻中两种操作温度的对比。将采集到的COCs随机分为三组,对照组、39℃组和25℃组。对照组不经冷冻直接进行IVM、IVF和早期胚胎IVC。两个液氦OPS法玻璃化冷冻组除操作温度不同外,其他操作均相同,解冻后分别进行IVM、IVF和早期胚胎IVC。结果表明:与对照组卵母细胞的形态正常率、成熟率、卵裂率和囊胚率(100%、84.6%、71.5%和40.6%)相比,两个冷冻组的各项指标均显著降低(P<0.05)。两个冷冻组中,39℃组和25℃组中的形态正常率分别为89.2%和85.8%,差异不显著(P﹥0.05)。39℃组卵母细胞的成熟率、卵裂率、囊胚率分别是51.4%、41.2%和10.0%,均显著高于25℃组(45.7%、34.1%和6.3%;P<0.05)。试验3:最佳预处理时间的筛选。将采集到的COCs随机分为四组,对照组、1 min预处理组、3 min预处理组和5 min预处理组。对照组不经冷冻直接进行IVM、IVF和早期胚胎IVC。三个液氦OPS法玻璃化冷冻组除在冷冻平衡液(VS1)中的预处理时间不同外,其他操作均相同。解冻后分别进行IVM、IVF和早期胚胎IVC,结果显示:与对照组卵母细胞的形态正常率、成熟率、卵裂率和囊胚率(100%、84.0%、70.6%和40.1%)相比,三个冷冻组的各项指标均显著降低(P<0.05)。三个冷冻组中,1 min组、3 min组和5 min组解冻后卵母细胞的形态正常率分别为87.7%、87.2%和86.4%,彼此之间差异不显著(P﹥0.05)。1min组解冻后卵母细胞的成熟率、卵裂率和囊胚率(49.6%、39.6%和10.4%)与3min组(47.4%、37.0%和8.8%)差异不显著(P﹥0.05),但却显著高于5min组(41.0%、32.0%、6.1%;P<0.05)。结论:液氦OPS玻璃化冷冻法的最佳冷冻保护液是EDS35,最佳操作温度为39℃,最佳预处理时间为1min。