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禽大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)引起的一种常见的局部或全身性感染的细菌性传染病,且易与其它病原性细菌、病毒并发或混合感染。目前,该病己成为危害养禽业的重要细菌病,给世界范围内养禽业造成了巨大的经济损失。病原性大肠杆菌天然形成了特定利用铁元素的摄取系统(specific iron assimilation system),这一系统由气杆菌素(aerobactin)的合成以及气杆菌素特定的外膜蛋白受体(由iutA编码)两部分组成。Williams最早在大肠杆菌中发现了这一系统,细菌的这两种成分在铁含量很少的情况下,均能被强烈地诱导表达。Lafont等研究表明,气杆菌素合成的相关基因只存在于有毒力的菌株,在无毒力菌株中并没有发现。编码气杆菌素的5个基因,共处于一个操纵子,位于ColV这一大质粒上,其中参与气杆菌素合成的是iucA、iucB、 iucC和iucD4个基因,而iutA编码一种膜蛋白受体。本研究旨在探讨编码气杆菌素的iucA、iutA基因以及aerobactin和sit操纵子与APEC致病性间的关系,了解APEC iucA、 iutA以及aerobactin和sit操纵子基因突变株的生物学特性,为了解APEC的致病机理和特异性防治措施奠定基础。本研究运用同源重组的方法构建了E058ΔiucA、E058ΔiucAΔiutA及E058Δvir基因缺失突变株,其中vir包括sit及aerobactin操纵子的15kb大小的片段。同时将含iucA完整阅读框的质粒pGEX-6P-1-iucA电转化突变株E058ΔiucA,从而筛选获得回复株Re-E058AiucA。PCR扩增带酶切位点的iucA基因并插入到pBSK载体的多克隆位点中,然后运用分子克隆方法将Zeocin抗性基因插入到目的基因iucA中,构建出带Zeocin抗性基因的质粒pS-iucA-Zeo。PCR扩增片段iucA-Zeo,并电转化入带有质粒pKD46的禽病原性大肠杆菌分离株E058中,运用同源重组的方法,筛选出基因突变株E058AiucA,将片段iutA-Kan电转化入带有质粒pKD46的单突变株E058ΔiucA中,筛选出双突变株E058AiucAAiutA。以质粒pUC4K为模板,PCR扩增片段,电转化带有质粒pKD46的E058菌株中,运用同源重组的方法,筛选出基因突变株E058Δvir。Southern blot结果表明Zeocin、Kanamycin抗性基因在APEC E058突变株质粒中的插入是单拷贝的；RT-PCR结果表明iucA、iutA基因的缺失只影响其本身的表达,而未影响其上下游基因的表达。Aerobactin production试验结果显示突变株E058ΔiucA、 E058ΔiucAΔiutA、E058Δvir不能产生aerobactin,而野生株E058、回复株Re-E058ΔiucA都可以产生aerobactin。生长曲线的测定结果显示突变株E058ΔiucA、E058ΔiucAΔiutA、 E058Δvir和亲本株E058在生长速度上没有显著差异；E058、E058AiucA、E058AiucAAiutA及E058Δvir株的半数致死量(LD50)分别为104.4、105.0、104.8和105.0CFU；鸡巨噬细胞HD—11吞噬试验结果表明突变株与亲本株的侵袭能力没有显著差异；体外竞争结果显示,突变株较E058株轻度致弱；体内竞争实验表明,与野生株E058相比,突变株E058AiucA、 E058ΔiucAAiutA毒力高度致弱；动态分布试验结果表明,突变株E058AiucA在心血中含菌量是12CFU.ml-1(p<0.001),肝脏含菌量6.3×102CFU.g-1(p<0.001),脾脏含菌量7.1×103CFU.g-1(p<0.01),肺脏含菌量7.8×103CFU.g-1(p<0.001),肾脏含菌9.4×102CFU.g-1(p<0.001), E058AiucAAiutA心血带菌量15CFU.ml-1(p<0.001),肝脏含菌量94CFU.g-1(p<0.001),脾脏含菌量9.1×102CFU.g-1(p<0.001),肺脏含菌量3.6×103CFU.g-1(p<0.001),肾脏含菌量1.4×102CFU.g-1(p<0.001), E058Avir心血带菌量15CFU.ml-1(p<0.001),肝脏含菌量1.05×102CFU.g-1(p<0.001),脾脏含菌量3.2×103CFU.g-1(p<0.001),肺脏含菌量6.8×103CFU.g-1(p<0.001),肾脏含菌量96CFU.g-1(p<0.001),而E058在脏器中的含菌量分别是心血8.2×102CFU.ml-1,肝脏4.2×104CFU.g-1,脾脏8.8×104CFU.g-1,肺脏1.3×105CFU.g-1,肾脏3.7×104CFU.g-1,与野生株相比,三株突变株均为高度致弱。