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从海南省三亚海域采集分离了克氏前沟藻Amphidinium klebsii藻种,并在实验室成功地进行了人工培养。利用光学显微镜对克氏前沟藻(三亚株)进行观察,同时对其生长特性进行了初步研究。通过溶血实验、卤虫毒性实验和小白鼠毒性实验对克氏前沟藻次生代谢产物的毒性进行了初步的研究。卤虫毒性实验结果表明,与对照组相比,各实验浓度梯度下的藻细胞对卤虫的致死效果均不明显,当细胞浓度达到1.0×105cells/ml时,卤虫致死率仅为23.3%;溶血实验结果表明,克氏前沟藻在稳定期初期单位体积溶血活性最高,而稳定期末期单位细胞溶血活性最高,其次生代谢产物乙酸乙酯部位的溶血活性约为正丁醇部位的10倍;小白鼠毒性实验结果表明,克氏前沟藻次生代谢产物的正丁醇部位对小白鼠有致死作用,半致死量(LD50)为2.0×107cells。
用3种培养基ES、K和f/2培养克氏前沟藻,探讨了ES/2、ES、2ES、K/2、K、2K、f/4、f/2、f对克氏前沟藻生长及产毒的影响。研究结果表明克氏前沟藻在f/2培养基中生长最好,最大细胞密度为1.17×105cells/ml,但克氏前沟藻细胞密度在K及f/2培养基中差异不显著(p>0.05);在K培养基中溶血活性最高,单位体积溶血活性为300.2 HU/L。
以改良K培养基为基础,通过设定不同的盐度、N、P浓度水平,探讨N、P营养盐对克氏前沟藻(Amphidinium klebsii)三亚株生长及产毒特性的影响。研究结果表明,盐度、N、P均为影响克氏前沟藻生长和产毒的重要因素。低盐度、N、P(盐度<30,N≤4.665×10-4 mol/L,P≤2.000×10-5mol/L)不利于克氏前沟藻生物量的积累,但能促进其毒素的产生;中盐度、N、P(30<盐度<40,4.665×104mol/L<N<37.320×10-4mol/L,2.000×10-5mol/L<p<16.000×10-5mol/L)有利于克氏前沟藻生物量的积累,却不利于毒素的产生;高盐度、N、P(盐度≥40,N≥37.320×10-4mol/L,P>16.000×10-5mol/L)则会延缓克氏前沟藻的增长,但能促进毒素的产生。在实验范围内,适合克氏前沟藻生长的盐度、N、P浓度范围分别为30-40,4.665×10-4-37.320×10r4mol/L,2.000×10-5-16.000×10-5mol/L。当盐度为35,N浓度9.330×10-4mol/L,P浓度为4.000×10-5mol/L时,细胞密度最大,为1.237×105cells/ml,单位体积溶血活性达到最高值,为347.48HU/L。
基于N、P、盐度三种环境因子对克氏前沟藻生长及产毒影响的实验结果,设计N、P、盐度三因素三水平正交实验,研究了N、P、盐度三种环境因子组合对克氏前沟藻生长及产毒特性的影响,实验结果显示,在实验范围内,N对克氏前沟藻生长及产毒的影响最大,克氏前沟藻的最佳生长和产毒条件组合为N浓度为9.330×10-4mol/L,P浓度为4.000×10-5mol/L,盐度为30。
利用固体培养基培养克氏前沟藻(Amphidinium klebsii),探讨了适合克氏前沟藻保藏的固体培养基浓度及类型。实验结果表明固体培养基Ⅰ(0.2%的琼脂)和固体培养基Ⅱ(上层0.2%琼脂糖(凝胶温度24-28℃)+下层0.2%琼脂糖(凝胶温度35-37℃))适合克氏前沟藻的保藏,克氏前沟藻能在这两种培养基上保存5-6个月,且转至液体培养基中1天能恢复活力:固体培养基Ⅲ(0.2%琼脂糖(凝胶温度35-37℃))和固体培养基Ⅳ(0.1%植物凝胶)不适合克氏前沟藻的保藏。