成体心肌细胞是终末分化的细胞，一旦损伤只能由无收缩能力的纤维组织所代替，目前对心肌梗塞的一些治疗手段如冠状动脉旁路移植术，虽然能恢复心脏血管的再灌注，但却不能逆转已坏死的心肌,所以往往随该类收缩细胞的缺失而导致急性心衰造成死亡。所谓心脏器官中的细胞移植，实质上即把健康的有关细胞移植到病损的心脏中，当前这项研究已逐渐被认为是增强心脏功能及限制心梗扩大的重要途径。目前有关细胞移植治疗心梗的研究主要集中在3个方面：（1）胎儿心肌细胞移植。（2）胚胎干细胞来源的心肌细胞移植。（3）骨骼肌卫星细胞移植。研究表明三种方法都有一定的疗效，但胎儿心肌细胞及胚胎干细胞很难得到，在培养时扩增的能力也有限，移植时有免疫排斥反应，同时还面临道义及政治上的谴责，所以很难在临床上应用。学者们现在把注意力集中到与心肌具有同源性而且结构和功能具有一定类似性的骨骼肌方面，而且更值得关注的是，与骨骼肌相伴的肌卫星细胞，在骨骼肌再生中所起的作用及其自我更新能力，使研究者们认为这一细胞或许是可用于治疗心梗，改善心脏功能的潜能性细胞。众所周知，骨骼肌卫星细胞是成体骨骼肌中位于肌细胞膜和基膜之间具有增殖分化潜能的肌源性干细胞,平时处于未分化状态，当骨骼肌受损时能被激活进入细胞周期，然后与受损的肌纤维融合，恢复骨骼肌的连续性及功能。应用骨骼肌卫星细胞作为供体细胞有很多理想的特性，如在体外未分化状态有增殖能力，在缺血组织内仍然能够成活，用自体卫星细胞移植，无免疫排斥反应。卫星细胞细胞移植首先应用于肌营养不良萎缩症，后来科学家又将卫星细胞移植用于治疗心梗，并发现卫星细胞移植到心梗心肌后能够成活，心脏功能有了明显改善。由于此项技术在临床上有广泛的应用前景，引起了许多科学家的关注。目前此项研究虽然取得了一些成果，但还存在很多急待解决的问题，如（1）测定移植细胞的成活率，找到提高移植细胞成活率的方法；（2）心梗面积多大时进行细胞移植会更有效；（3）发明一种长期标记移植细胞的可靠技术，用此技术搞清<WP=5>被成功移植细胞的分化状态；（4）确定最佳的移植细胞数量及移植时间，完善细胞移植方法，使临床应用方便，病人痛苦少。基于以上问题本课题拟分离纯化新生大鼠骨骼肌卫星细胞，观察其生物学特性，用不同方法标记细胞，探讨标记物毒性及标记率。为了使肌卫星细胞在体外快速增殖，用多种生长因子作用于肌卫星细胞，将胶体金标记的细胞移植到正常心肌组织，观察其生长状态，探讨胶体金标记方法在体内标记的可行性，以及将胶体金标记的卫星细胞移植到SD大鼠冷冻心梗模型中的心梗区中央部位，观察移植细胞的生长分化情况，探讨其在治疗心梗中的作用。本实验共分四个部分。方法与结果1. 新生大鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养及标记方法取生后3日龄新生SD大鼠四肢骨骼肌，经胶原酶、透明质酸酶及链酶蛋白酶消化，用等密度沉降离心法分离出骨骼肌卫星细胞，观察其生长规律，检测分裂指数及生长曲线。用胶体金、DAPI及BrdU标记液分别标记细胞8h、24h、48h，测标记后细胞的生长曲线及标记率。结果表明分离所得肌卫星细胞纯度95%以上，梭形，第3-5天增殖旺盛，5代以内生长较快,一般在培养第5天细胞排列出现方向性，并开始融合成肌管。研究发现三种标记方法对肌卫星细胞有不同程度毒性。胶体金标记法毒性最小，标记率100%，DAPI标记细胞率为100%，BrdU毒性最大且标记率仅为10%。研究者认为本实验方法简单、快速，所得肌卫星细胞纯度高，性能好。胶体金标记法适合于电镜研究，DAPI标记法适合于光镜研究，BrdU标记法较差。2. EGF、bFGF和PHGF对大鼠骨骼肌卫星细胞增殖的影响 取第四代新生大鼠骨骼肌卫星细胞，用MTT法、流式细胞技术检测细胞周期方法、溴脱氧核甘尿嘧啶(bromodeoxyuridine,BrdU)掺入法及免疫细胞化学检测增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen ，PCNA）的方法探讨了表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）及促肝细胞生长因子（hepatocyte growth-promoting factor ，PHGF）对大鼠骨骼肌卫星细胞增殖的影响。结果表明bFGF、PHGF对骨骼肌卫星细胞有较强的促增殖作用，且两者之间无差别，bFGF最佳作用浓度为5μg /L ，PHGF最佳作用浓度为10μg /ml 。本实验证实国产牛bFGF对卫星细胞的增殖作用明<WP=6>显不如进口人bFGF，这可能与药物质量或种属因素有关，在选择作用因子时应予以考虑。与其他生长因子相比，PHGF价格低廉易于获取，适宜推广。EGF增殖作用不明显。3. 骨骼肌卫星细胞移植到大鼠体内生长发育的初步研究 将胶体金标记的骨骼肌卫星细胞移植到正常大鼠心肌中，用免疫组化、共聚焦免疫荧光双标染色方法及电镜多种方法探讨胶体金标记方法的可行性，卫星细胞的生长分化情况，为卫星细胞移植治疗心梗研究提供参考资料。结果表明将胶体金标记16小时的卫星细胞移植后，移植细胞可以在宿主心肌中生长并在肉眼下可见移植部位颜色变黑，能够使我们快速找到移植位点，减少了取材的盲目性。移植?