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新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus，NGPV)或称之为鹅细小病毒变异株，自2015年起在我国樱桃谷鸭中广泛流行，所引起的疾病称之为短喙与矮小综合征(Short beak and dwarfism syndrome，SBDS)。感染鸭与健康同龄鸭相比体型发育矮小、喙部萎缩，部分鸭舌头外伸。NGPV的感染率在80％左右，感染鸭死亡率很低，但由于胴体品质差难以售卖，给养殖业造成很高的经济损失。
对NGPV的分离先前多有报道，但分离率差别很大，有报道认为需要用鸭胚盲传数代NGPV才能适应。为了细致了解NGPV对禽胚的适应性以及不同毒株在致病性上的差异，并深入解析NGPV基因组的分子特征，本研究对2016～2019年收集的三份SBDS病料进行了病毒的分离，对分离株的完整基因组序列进行测定，并与已发表的NGPV毒株及经典鹅细小病毒(Goose parvovirus，GPV)毒株进行比较，解析了NGPV毒株间共同的分子特征及不同年代分离株之间的差异。通过动物感染试验，确认NGPV分离株感染2日龄樱桃谷鸭可以复制出短喙、矮小的特征性临床症状。通过反向遗传学技术构建了嵌合NGPV保护性抗原基因VP1的pSYG-HTVP1重组病毒，该病毒在鹅胚上增殖性能较野毒株有了很大提高并能产生较高的病毒滴度。以pSYG-HTVP1重组病毒制备的灭活疫苗免疫樱桃谷鸭和蛋鸡，均能够产生较高的血清抗体和卵黄抗体效价，表明这是一株具有潜在利用价值的候选疫苗株。通过对人工感染NGPV的樱桃谷鸭内脏组织进行病毒载量测定，确定了病毒在组织器官中分布的大体规律，这为进一步探索NGPV的致病机制开拓了思路。
一、樱桃谷鸭源新型鹅细小病毒的分离、分子特征及致病性
为了深入揭示NGPV的鹅胚增殖特性及分子特征，对从山东省不同地区不同时间点采集的三份SBDS典型病例的肝脾病料进行了病毒分离。通过接种9日龄非免疫鹅胚成功分离到三株NGPV，分别为SDHT16、SDJN19和SDLC19。三株病毒均能在鹅胚中稳定传代，但致死鹅胚的时间明显长于经典型GPV。SDHT16、SDJN19和SDLC19致死鹅胚的平均时间分别为159h、155h和137h。
以SDHT16和SDJN19株的第2代鹅胚尿囊液经1∶10稀释后分别接种16个9日龄非免疫樱桃谷鸭胚，结果两个毒株均能致死全部鸭胚，但两个毒株致死鸭胚的时间有差异，SDHT16株致死全部鸭胚的平均死亡时间为158h，而SDJN19株致死全部鸭胚的平均时间为108h，差异极显著(P＜0.01)。SDHT16株和SDJN19株对樱桃谷鸭胚的半数致死量(ELD50)分别为5×102.5/mL和5×105.5/mL。鹅胚和鸭胚的感染实验结果表明，不同年代的NGPV毒株在生物学特性上存在一定差异，新近分离的SDJN19株对樱桃谷鸭胚和鹅胚的适应性较2016年的毒株SDHT16均有了很大的提高。
对三个分离株的全基因组进行了PCR扩增和序列测定。并与先前分离的NGPV毒株及经典GPV毒株进行了比较。结果表明，分离于2019年的SDJN19和SDLC19之间的同源性为99.7％，两者与分离于2016年的SDHT16株的同源性为98.9％～99.2％。三个毒株与经典GPV强毒株的同源性则稍低，为95.2％～96.1％。
对三株NGPV与已发表的NGPV毒株和经典GPV强毒株的编码蛋白进行比对分析。结果表明与国内经典GPV强毒株相比，NGPV毒株结构蛋白VP1共产生了16个氨基酸位点突变，其中9个氨基酸位点与欧洲的GPV B株相同。非结构蛋白Rep1则产生了12个氨基酸位点突变。与经典GPV强毒株LH的末端倒置重复序列(Inverted terminal repeats，ITR)相比，SDHT16、SDJN19和SDLC19在ITR的回文区茎部分别多出2个、4个、4个碱基，他们之间ITR的同源性达到98.1％～100.0％,而与LH株的同源性为93.0％～94.0％。
分别用SDJN19株和SDHT16株进行了2日龄樱桃谷鸭的感染试验。结果表明，两个毒株感染雏鸭均可复制出典型的SBDS症状，如发育矮小、喙萎缩，部分舌头外伸，存活鸭平均体重均低于对照组。但2个毒株之间也表现出一定差异性，SDJN19株感染的10只雏鸭，在20天的观察期内死亡3只，死亡率为30％，而SDHT16株感染组无一死亡。感染实验结果表明，NGPV确实是引起樱桃谷鸭SBDS的病原，不同年代的NGPV分离株在致病性上可能存在着差异。本研究结果为今后进一步深入研究NGPV的致病机制奠定了基础。
二、短喙与矮小综合征候选疫苗株的构建
鉴于NGPV毒株在鹅胚上的增殖性能不及经典型GPV，很不利于用鹅胚作为载体进行病毒的扩增，因此，对现有野毒株进行改造，以使其更好地在鹅胚中增殖，同时又能保留原有的抗原性成为当务之急。本研究中，利用GPV鹅胚化的疫苗株SYG61v高度适应鹅胚这一特点，以其感染性克隆质粒pSYG61v为骨架，通过选择合适的酶切位点，结合overlap PCR技术，用NGPV的VP1基因片段替换pSYG61v的相应区域，形成了嵌合NGPV VP1基因的感染性克隆质粒pSYG-HTVP1。将pSYG-HTVP1质粒转染鹅胚拯救出感染性病毒，拯救病毒携带NGPV的保护性抗原基因VP1，而ITR和Rep基因与SYG61v一致。拯救病毒可在鹅胚上良好复制和传代，接种11日龄鹅胚，能够在112h～137h之间致死鹅胚，平均时间为125h，较NGPV野毒株SDHT16获得了很大提升。pSYG-HTVP1第二代鹅胚尿囊液中经qPCR检测病毒含量达到2.5×107copies/μL。
将pSYG-HTVP1拯救病毒在鹅胚上增殖，收集尿囊液用甲醛灭活后，制备油乳剂灭活苗，疫苗分别免疫20日龄樱桃谷鸭和开产蛋鸡。结果显示，一次免疫樱桃谷鸭就能获得1∶8的平均血清抗体效价。经两次免疫开产蛋鸡，在卵黄中能检测到1∶64以上的抗体效价，维持时间达到7周以上。初步的试验结果表明pSYG-HTVP1是一株具有潜在利用价值的疫苗株，为最终创制一种防治樱桃谷鸭SBDS的有效生物制剂提供了坚实基础。
三、樱桃谷鸭人工感染NGPV后脏器组织的病毒载量分析
为了探究SBDS病程发展与脏器组织中病毒载量分布之间的关系，本研究以NGPV SDJN19株感染2日龄樱桃谷雏鸭，饲养观察20天。分别在1天、4天、7天、10天、13天、16天、19天随机处死3只鸭，采集其脏器组织并提取病毒DNA，通过荧光定量PCR方法进行病毒载量分析。试验结果表明，多数器官组织在接毒后1～4天病毒载量达到峰值，之后缓慢下降，至19天，肝、脾、肾的病毒载量在104copies/g左右，这与SBDS的低死亡率特征相符合。在检查的所有器官组织中，肠道中的病毒含量为最高，接种后1天即达到峰值，约1010copies/g，至19天仍能达到106copies/g水平，表明NGPV感染的雏鸭具有较长时间的泄殖腔排毒能力，因此在鸭苗进场前实行严格的场地消毒显得很有必要。另外，在血液中也检测出较高的病毒含量，且下降平稳，即使在感染后第19天，也能达到106copies/mL。血液中持续存在较高水平的病毒载量，可能影响到与骨骼发育相关的细胞功能异常，从而导致患病鸭出现短喙及骨骼发育不良的临床特征。樱桃谷鸭人工感染NGPV后脏器组织的病毒载量分析阐释了病毒在组织器官中分布的大体规律，这为进一步探索NGPV的致病机制开拓了思路。
对NGPV的分离先前多有报道，但分离率差别很大，有报道认为需要用鸭胚盲传数代NGPV才能适应。为了细致了解NGPV对禽胚的适应性以及不同毒株在致病性上的差异，并深入解析NGPV基因组的分子特征，本研究对2016～2019年收集的三份SBDS病料进行了病毒的分离，对分离株的完整基因组序列进行测定，并与已发表的NGPV毒株及经典鹅细小病毒(Goose parvovirus，GPV)毒株进行比较，解析了NGPV毒株间共同的分子特征及不同年代分离株之间的差异。通过动物感染试验，确认NGPV分离株感染2日龄樱桃谷鸭可以复制出短喙、矮小的特征性临床症状。通过反向遗传学技术构建了嵌合NGPV保护性抗原基因VP1的pSYG-HTVP1重组病毒，该病毒在鹅胚上增殖性能较野毒株有了很大提高并能产生较高的病毒滴度。以pSYG-HTVP1重组病毒制备的灭活疫苗免疫樱桃谷鸭和蛋鸡，均能够产生较高的血清抗体和卵黄抗体效价，表明这是一株具有潜在利用价值的候选疫苗株。通过对人工感染NGPV的樱桃谷鸭内脏组织进行病毒载量测定，确定了病毒在组织器官中分布的大体规律，这为进一步探索NGPV的致病机制开拓了思路。
一、樱桃谷鸭源新型鹅细小病毒的分离、分子特征及致病性
为了深入揭示NGPV的鹅胚增殖特性及分子特征，对从山东省不同地区不同时间点采集的三份SBDS典型病例的肝脾病料进行了病毒分离。通过接种9日龄非免疫鹅胚成功分离到三株NGPV，分别为SDHT16、SDJN19和SDLC19。三株病毒均能在鹅胚中稳定传代，但致死鹅胚的时间明显长于经典型GPV。SDHT16、SDJN19和SDLC19致死鹅胚的平均时间分别为159h、155h和137h。
以SDHT16和SDJN19株的第2代鹅胚尿囊液经1∶10稀释后分别接种16个9日龄非免疫樱桃谷鸭胚，结果两个毒株均能致死全部鸭胚，但两个毒株致死鸭胚的时间有差异，SDHT16株致死全部鸭胚的平均死亡时间为158h，而SDJN19株致死全部鸭胚的平均时间为108h，差异极显著(P＜0.01)。SDHT16株和SDJN19株对樱桃谷鸭胚的半数致死量(ELD50)分别为5×102.5/mL和5×105.5/mL。鹅胚和鸭胚的感染实验结果表明，不同年代的NGPV毒株在生物学特性上存在一定差异，新近分离的SDJN19株对樱桃谷鸭胚和鹅胚的适应性较2016年的毒株SDHT16均有了很大的提高。
对三个分离株的全基因组进行了PCR扩增和序列测定。并与先前分离的NGPV毒株及经典GPV毒株进行了比较。结果表明，分离于2019年的SDJN19和SDLC19之间的同源性为99.7％，两者与分离于2016年的SDHT16株的同源性为98.9％～99.2％。三个毒株与经典GPV强毒株的同源性则稍低，为95.2％～96.1％。
对三株NGPV与已发表的NGPV毒株和经典GPV强毒株的编码蛋白进行比对分析。结果表明与国内经典GPV强毒株相比，NGPV毒株结构蛋白VP1共产生了16个氨基酸位点突变，其中9个氨基酸位点与欧洲的GPV B株相同。非结构蛋白Rep1则产生了12个氨基酸位点突变。与经典GPV强毒株LH的末端倒置重复序列(Inverted terminal repeats，ITR)相比，SDHT16、SDJN19和SDLC19在ITR的回文区茎部分别多出2个、4个、4个碱基，他们之间ITR的同源性达到98.1％～100.0％,而与LH株的同源性为93.0％～94.0％。
分别用SDJN19株和SDHT16株进行了2日龄樱桃谷鸭的感染试验。结果表明，两个毒株感染雏鸭均可复制出典型的SBDS症状，如发育矮小、喙萎缩，部分舌头外伸，存活鸭平均体重均低于对照组。但2个毒株之间也表现出一定差异性，SDJN19株感染的10只雏鸭，在20天的观察期内死亡3只，死亡率为30％，而SDHT16株感染组无一死亡。感染实验结果表明，NGPV确实是引起樱桃谷鸭SBDS的病原，不同年代的NGPV分离株在致病性上可能存在着差异。本研究结果为今后进一步深入研究NGPV的致病机制奠定了基础。
二、短喙与矮小综合征候选疫苗株的构建
鉴于NGPV毒株在鹅胚上的增殖性能不及经典型GPV，很不利于用鹅胚作为载体进行病毒的扩增，因此，对现有野毒株进行改造，以使其更好地在鹅胚中增殖，同时又能保留原有的抗原性成为当务之急。本研究中，利用GPV鹅胚化的疫苗株SYG61v高度适应鹅胚这一特点，以其感染性克隆质粒pSYG61v为骨架，通过选择合适的酶切位点，结合overlap PCR技术，用NGPV的VP1基因片段替换pSYG61v的相应区域，形成了嵌合NGPV VP1基因的感染性克隆质粒pSYG-HTVP1。将pSYG-HTVP1质粒转染鹅胚拯救出感染性病毒，拯救病毒携带NGPV的保护性抗原基因VP1，而ITR和Rep基因与SYG61v一致。拯救病毒可在鹅胚上良好复制和传代，接种11日龄鹅胚，能够在112h～137h之间致死鹅胚，平均时间为125h，较NGPV野毒株SDHT16获得了很大提升。pSYG-HTVP1第二代鹅胚尿囊液中经qPCR检测病毒含量达到2.5×107copies/μL。
将pSYG-HTVP1拯救病毒在鹅胚上增殖，收集尿囊液用甲醛灭活后，制备油乳剂灭活苗，疫苗分别免疫20日龄樱桃谷鸭和开产蛋鸡。结果显示，一次免疫樱桃谷鸭就能获得1∶8的平均血清抗体效价。经两次免疫开产蛋鸡，在卵黄中能检测到1∶64以上的抗体效价，维持时间达到7周以上。初步的试验结果表明pSYG-HTVP1是一株具有潜在利用价值的疫苗株，为最终创制一种防治樱桃谷鸭SBDS的有效生物制剂提供了坚实基础。
三、樱桃谷鸭人工感染NGPV后脏器组织的病毒载量分析
为了探究SBDS病程发展与脏器组织中病毒载量分布之间的关系，本研究以NGPV SDJN19株感染2日龄樱桃谷雏鸭，饲养观察20天。分别在1天、4天、7天、10天、13天、16天、19天随机处死3只鸭，采集其脏器组织并提取病毒DNA，通过荧光定量PCR方法进行病毒载量分析。试验结果表明，多数器官组织在接毒后1～4天病毒载量达到峰值，之后缓慢下降，至19天，肝、脾、肾的病毒载量在104copies/g左右，这与SBDS的低死亡率特征相符合。在检查的所有器官组织中，肠道中的病毒含量为最高，接种后1天即达到峰值，约1010copies/g，至19天仍能达到106copies/g水平，表明NGPV感染的雏鸭具有较长时间的泄殖腔排毒能力，因此在鸭苗进场前实行严格的场地消毒显得很有必要。另外，在血液中也检测出较高的病毒含量，且下降平稳，即使在感染后第19天，也能达到106copies/mL。血液中持续存在较高水平的病毒载量，可能影响到与骨骼发育相关的细胞功能异常，从而导致患病鸭出现短喙及骨骼发育不良的临床特征。樱桃谷鸭人工感染NGPV后脏器组织的病毒载量分析阐释了病毒在组织器官中分布的大体规律，这为进一步探索NGPV的致病机制开拓了思路。