【摘 要】
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糖基化是蛋白质翻译后修饰之一,在细胞生命活动的调控中发挥着重要的作用。糖基化过程中合成不同类型的寡糖链与蛋白质骨架连接,包括与丝氨酸或苏氨酸残基连接的O-糖链和与Asn-X-Ser/Thr序列中天冬酰胺残基连接的N-糖链。糖链通过与糖结合蛋白之间的相互作用来实现其生物学功能,要进行糖链结构与功能之间关系的研究则需要获得大量的结构明确、结构多样的糖链单体。目前,N-糖链的释放方法主要有酶解法和化学法
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糖基化是蛋白质翻译后修饰之一,在细胞生命活动的调控中发挥着重要的作用。糖基化过程中合成不同类型的寡糖链与蛋白质骨架连接,包括与丝氨酸或苏氨酸残基连接的O-糖链和与Asn-X-Ser/Thr序列中天冬酰胺残基连接的N-糖链。糖链通过与糖结合蛋白之间的相互作用来实现其生物学功能,要进行糖链结构与功能之间关系的研究则需要获得大量的结构明确、结构多样的糖链单体。目前,N-糖链的释放方法主要有酶解法和化学法;酶解法主要是利用高度特异性的糖苷酶(如:PNGase F、PNGase A)或蛋白水解酶Pronase E结合糖基天冬酰胺酶(GA酶)来进行酶切,从而获得游离糖链。但酶的价格昂贵,一般多用于糖链的分析而不能用于糖链的大规模制备。基于化学法成本低廉且通用性强的优点,进行N-糖链的制备时多采用化学法。而目前存在的化学法如肼解法反应条件苛刻、毒性大、会有副产物生成;含有饱和碳酸铵的浓氨水(60℃水浴反应40小时)只能非还原性释放出部分完整N-糖链,因此均不适合应用于糖链的大规模制备。次氯酸钠氧化法虽可以进行糖链的大规模制备,但会使部分N-糖链还原末端的N-GlcNAc丢失。因此,发展一种具有通用性的N-糖链的化学释放方法用于糖链的大规模制备具有重要的意义。本研究建立了一种简单快速、通用性强、成本低廉的N-糖链解离的新方法,得到还原性N-糖链;并将该方法用于N-糖链的大规模制备,对制备得到的糖链衍生化后用于二维高效液相色谱(2D-HPLC)的分离,从而获得N-糖链单体。研究结果如下:1.建立了一种释放N-糖链的新方法,将糖蛋白溶解于浓氨水中,在密闭容器中60℃水浴反应16小时,然后经过C18和石墨碳柱纯化,得到还原性N-糖链。该方法成本低廉,操作简单,并且可以用于中性N-糖链、酸性N-糖链以及含有核心α-1,3-岩藻糖修饰的N-糖链的释放;所得N-糖链均为还原性糖链,可以标记紫外或荧光试剂后用于HPLC分离分析。我们已成功地将此方法应用于RNase B、鸡白蛋白、胎牛血清蛋白、花生蛋白、银杏种子蛋白、大豆蛋白及鸡蛋清等生物样品。2.基于此方法操作简单、成本低廉、通用性强等优点,我们利用此方法进行了还原性N-糖链的规模化制备。在已建立的方法的基础上,扩大了反应体系;待反应结束后,利用酸沉淀去除大量蛋白,并以自制C18和石墨碳柱(20 g/300 mL)对N-糖链进行纯化。其中酸沉淀蛋白这一步骤降低了后续样品纯化的成本。目前制备的鸡白蛋白、胎牛血清蛋白、大豆蛋白及鸡蛋清中的N-糖链均已达到克级。3.取鸡白蛋白及大豆蛋白中制备所得还原性N-糖链混合物标记苯磺酰肼(BSH)后,利用亲水色谱柱进行一维HPLC(HILIC-HPLC)初步分离后脱标记,得到不同的还原性N-糖链组分。不同组分的还原性N-糖链可根据需要偶联不同的标记试剂,并结合2D-HPLC分离获得高纯度的N-糖链衍生物单体用于多方面的研究。在本研究中我们选用了双官能团试剂2-氨基-N-(2-氨基乙基)-苯甲酰胺(AEAB)进行标记并结合C18柱(RP-HPLC)对其进行二维色谱分离,从鸡白蛋白中得到21种N-糖链衍生物单体,从大豆蛋白中得到8种N-糖链衍生物单体。得到的具有活性伯烷基胺的N-糖链衍生物单体,可以有效地固定在糖芯片表面,进一步用于糖链的功能研究。
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