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近年来,再生医学给脊髓损伤的治疗带来新的希望。胚胎干细胞(ESC)以其具有很强的增殖和分化能力,可被大量地诱导分化成为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞等优势,成为再生医学移植供体的理想来源。但由于胚胎干细胞直接移植体内具有形成畸胎瘤的危险,因此应用胚胎干细胞移植治疗脊髓损伤一般先在体外诱导分化出神经前体细胞或神经细胞,然后再移植进脊髓组织。也就是说胚胎干细胞移植治疗脊髓损伤的过程分为两部分,一是体外诱导胚胎干细胞分化成为纯度高、数量多、有功能的神经细胞；二是移植到脊髓内的细胞可以迁移、增殖以及与宿主组织形成很好的整合,从而发挥功能。目前胚胎干细胞的体外诱导分化方法虽已成熟,但还存在着诱导分化的细胞纯度低、数量少等问题,为此我们的实验首先关注胚胎干细胞的神经诱导分化率。神经分化的过程受多种信号通路的调控,其中SHH信号通路起着重要的作用。嘌呤衍生物Purmorphamine是小分子化合物,已经被证实能和SHH信号通路中的Smoothened结合,激活SHH信号通路,被认为是SHH的替代物,在发育中起着重要的作用。为此,我们应用Purmorphamine替代SHH,诱导胚胎干细胞分化,获得了纯度高、数量多、有功能的脊髓运动神经元和少突胶质细胞；检测了Purmorphamine替代SHH,能否引起SHH信号通路、背-腹轴通路、运动神经元和少突胶质细胞发育中相关基因的变化；同时观察了诱导分化的少突胶质前体细胞移植到脊髓损伤组织内,能否与宿主整合,进而迁移、分化来发挥修复损伤的作用。我们的具体工作如下：一、应用在小鼠胚胎干细胞的Olig2基因上转入GFP蛋白而建立的Olig2+-GFP+-mES为细胞模型。采用无血清培养方式,以不同浓度的Purmorphamine诱导拟胚体(EBs),通过细胞培养、免疫细胞化学、FACs和RT-PCR等方法观察其对胚胎干细胞定向分化为脊髓运动神经元和少突胶质细胞的作用,并初步探讨其诱导分化的作用机制。实验结果显示,Purmorphamine可以完全替代SHH促进胚胎干细胞向神经细胞分化；促进Olig2基因的表达；从而促进在EB8D后向脊髓运动神经元分化,分化率超过50%,引起与脊髓运动神经元相关基因的表达变化。促进在EB12D后向少突胶质细胞分化,分化率超过80%,引起与少突胶质细胞相关基因、背-腹轴通路和SHH信号通路相关基因的表达变化。上述结果表明,Purmorphamine可替代SHH诱导Olig2+-GFP+-mES分化为纯度高、有功能的脊髓运动神经元和少突胶质细胞。二、应用NYU-ImpactorⅡ建立大鼠脊髓撞击伤模型,将Purmorphamine诱导分化Olig2+-GFP+-mES而获得的Olig2+-GFP+-OPC移植到脊髓损伤组织内,通过免疫组织化学、透射电镜、Western blot、行为学和神经电生理等方法观察移植细胞是否促进脊髓功能的恢复,进而阐明细胞移植在脊髓损伤恢复中所起的作用。结果显示,Olig2+-GFP+-OPC能在宿主脊髓内存活和迁移,可以增殖分化为少突胶质细胞并形成髓鞘,使脊髓形态学结构达到部分恢复；Western blot检测显示神经丝蛋白和髓鞘碱性蛋白与损伤组相比较均有一定程度的恢复；行为学检测和电生理学检测显示大鼠脊髓运动功能和传导功能得到部分恢复。综上所述,Purmorphamine作为SHH的替代物,能有效地诱导Olig2+-GFP+-mES分化为高纯度、有功能的脊髓运动神经元和少突胶质细胞,并引起相关基因的改变；移植所诱导的Olig2+-GFP+-OPC可以促进大鼠脊髓损伤后功能和形态的部分恢复,从而促进脊髓损伤后再生和功能重建的作用,为日后临床应用细胞移植治疗脊髓损伤提供一定的实验依据。