论文部分内容阅读
棉蚜（Aphis gossypii Glover），是重要的农林害虫，可以响应光周期的变化进行孤雌生殖和有性生殖，此为生殖型多型现象；同时其还具有翅多型现象。棉蚜生殖型转变受到人们的普遍关注而背后分子机制一直不得而知。RNAi技术自发现以来就成为研究基因功能的重要工具，广泛应用于蜜蜂（Apoidea）、蟋蟀（Gryllidae）、果蝇（Drosophila melanogaster）、豌豆蚜（Acyrthosiphum pisim）等多种模式生物的研究中，但不同物种间RNAi干扰效率差异较大。前期，我们采用饲喂和注射法对棉蚜RNAi进行了较为系统的研究，同时我们也获得了性母诱导产生的必备条件，这些为开展棉蚜性母形成分子机制的研究奠定了基础。胰岛素信号通路参与调控多种昆虫的多型现象，如褐飞虱（Nilaparvata lugens）的长翅短翅、蜜蜂的工蜂蜂王分化。作为调控生物生长发育、代谢、生殖以及衰老等生理过程的重要激素，其在棉蚜生殖型转变中的作用机制仍不明了。 本研究以棉蚜为对象，选用胰岛素信号通路中的关键基因进行RNA干扰，通过检测干扰效率、观察表型以阐述胰岛素信号通路各基因对棉蚜性母形成的的影响。选用的基因有Insulin receptor1和Insulin receptor2（InR1和InR2）、Foxo、Akt和PI3K，采用显微注射的方法进行RNAi。同时本实验还探究了不同dsRNA处理对RNA干扰效率的影响，包括纳米壳聚糖包埋 dsRNA、穿膜蛋白和转染试剂混合 dsRNA。本实验对注射浓度与部位的选择，依据之前本实验室在做保幼激素受体Met RNAi时的结果，即最佳注射剂量10ng、最优注射部位中胸与后胸之间。结果如下：直接注射dsInR1和dsInR2，qRT-PCR检测G2代5 d、10 d和成虫的干扰效率，结果显示注射dsInR1有显著的干扰效率，并且干扰效率在成虫期能够达到73％，在第10 d干扰效率也能达到60%；此外，我们也发现干扰InR1对棉蚜的生殖以及翅的形成具有一定的影响，在 G2代成虫阶段出现了约16%的无翅棉蚜；对棉蚜进行解剖观察，发现干扰 InR1后的棉蚜的卵小管的数量明显减少，且同对照相比较发育明显受到影响。然而用壳聚糖包埋和穿膜蛋白混合dsInR1和dsInR2后对棉蚜进行干扰，qRT-PCR检测G2代出生后不同天数的干扰效率，结果并不似预想的能够提高干扰效率，而是几乎没有干扰效率，同时解剖观察并未发现处理组棉蚜卵巢有明显的变化。直接注射dsInR1对G1（gynopara-producer）代进行干扰，qRT-PCR检测G1代11d和12d的干扰效率，结果显示对InR1的干扰有一定的干扰效率，但干扰效率并不显著。此外同样的方法对Foxo、Akt和PI3K的干扰，结果不能实现RNAi。然而进一步的研究表明用转染试剂混合dsInR1进行注射，在G1代出生后12d中出现了显著的干扰效率，能够达到70%。这一结果为研究棉蚜性母形成过程分子机制的研究提供了有效的方法。