研究背景与目的：急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML）是一类以髓系造血干/祖细胞异常克隆增殖、分化障碍及凋亡受阻为特点的血液系统恶性肿瘤,在细胞遗传学和分子生物学方面具有高度异质性。现代细胞遗传学技术可以检测出大约30%的AML患者伴有重现性遗传学异常,其中t（8;21）（q22;q22）染色体易位是AML患者中常见的一种重现性染色体异常,该易位使21号染色体上的AML1基因与8号染色体上的ETO基因发生融合形成特异性的AML1/ETO融合基因,见于12%20%的AML,在FAB形态学分型的M2型中发生率约40%,偶见于其他亚型如M1和M4。AML部分成熟型的M2b亚型是中国学者于20世纪50年代末提出的,具有髓外浸润率高、治疗反应好、完全缓解率高、缓解期长等特点。此后大量研究发现AML-M2b亚型患者AML1/ETO融合基因阳性率高达90%以上。2001年世界卫生组织（WHO）将伴有t（8;21）（q22;q22）（AML1/ETO）的AML定义为独立亚型,还把具有该类特征性克隆结构的细胞遗传学异常确诊为AML,而不论其骨髓原始细胞百分比的多少。在AML的危险度分层中,AML1/ETO阳性往往被认为是AML预后较好的类型,可以经常规化疗取得较好的疗效,尤其是采取以大剂量阿糖胞苷为基础的化疗方案。但越来越多的研究表明,并非所有AML1/ETO阳性AML患者都能取得较好的治疗效果,有报道称该类患者一年内复发率高达30%或以上,因此,尚需结合其他因素如有无其他染色体异常、基因突变等进行综合评估该类型AML患者的预后。近年来,随着白血病MCM分型方案的完善和发展,众多无法被细胞遗传学方法检测出来的基因异常而又与AML患者预后相关的分子标志已越来越多的被发现,使得对AML患者不同预后的分析进入分子水平。人类淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein, APP）基因定位于21q21.3-22.05,编码一种Ⅰ型膜整合糖蛋白,可在人体大多数细胞中表达,调节神经元生长、突触发生和细胞黏附等多种生理过程。不少研究发现,APP基因在口腔鳞状上皮细胞癌、胰腺癌、甲状旁腺癌、结肠癌和乳腺癌等多种实体瘤细胞中异常高表达,起促进这些肿瘤细胞的增殖,且APP高表达提示预后不良。目前APP基因与白血病的研究报道较少。有学者利用寡核苷酸芯片技术分析伴21号染色体异常的AML患者与正常核型AML患者之间差异表达基因,结果发现APP基因在伴21号染色体异常的AML患者中显著高表达,并且荧光定量PCR检测结果也验证了APP mRNA在伴21号染色体异常的AML患者中的表达水平显著高于正常核型AML患者。我们实验组前期检测APP在AML各亚型患者骨髓单个核细胞（bone marrow mononuclear cells, BMMNCs）中的表达情况,发现APP基因在伴有AML1/ETO融合基因阳性的M2b型患者BMMNCs中的表达水平显著高于其他AML亚型。由此推测,APP基因可能与AML1/ETO阳性的白血病的发生发展及预后密切相关。然而,APP基因在AML1/ETO阳性的白血病患者的临床意义及相关功能尚不明确。本研究通过检测44例AML1/ETO阳性的AML患者BMMNCs中APP的表达水平,并分析其表达水平高低与临床疗效及预后的关系,从而明确APP基因在该类型白血病患者的临床意义。进一步通过慢病毒介导的RNA干扰（RNA interference, RNAi）技术稳定抑制伴有AML1/ETO融合基因阳性的Kasumi-1细胞系中的APP基因表达,观察APP基因表达沉默对Kasumi-1细胞增殖、凋亡、迁移等生物学行为的影响,并初步探讨了APP基因在调控AML1/ETO阳性白血病细胞迁移中的作用机制及药物panobinostat干预,从而为探索AML1/ETO阳性的AML患者新的治疗策略提供依据。研究内容和方法1.APP基因在AML1/ETO阳性的AML患者BMMNCs中表达水平收集我院2007年6月～2013年12月期间确诊为AML的住院患者骨髓标本44例（均为初诊患者）,且该44例患者经染色体核型分析、原位荧光免疫杂交（FISH）和PCR检测证实均存在t（8；21）（q22；q22）染色体异位和AML1/ETO融合基因表达阳性。采用人外周血淋巴细胞分离液分离出骨髓单个核细胞,荧光定量PCR实验方法检测患者BMMNCs中APPmRNA相对于内参β-actin的表达水平。2.APP表达水平高低与AML1/ETO阳性的AML患者临床疗效及预后分析以APP基因的mRNA表达中位水平为界,把低于和高于中位表达量的患者分成APP高表达组和APP低表达组。分析比较两组患者白血病髓外浸润（extramedullary infiltration, EMI）发生率、2疗程总完全缓解（complete remission,CR）率。所有病例随访截止日期为2013年12月18日,中位随访期为21月（2-88月）。比较高表达APP和低表达APP两组患者的无复发生存（relapse free survival, RFS）率及总生存（overall survival, OS）率,并分析APP表达水平高低与AML1/ETO阳性的AML患者预后的关系。3.慢病毒介导的shRNA抑制AML-M2b细胞系Kasumi-1的APP表达人类AML-M2b细胞系Kasumi-1具有特征性的t（821）（q22；q22）染色体易位和AML1/ETO融合基因阳性,是研究APP基因在AML1/ETO阳性的白血病细胞中功能的理想细胞模型。利用RNAi技术抑制Kasumi-1细胞中的APP基因以研究其功能。首先根据APP特异性有效小于扰RNA （small interfence RNA, siRNA）序列,交由上海吉凯基因化学技术有限公司合成相应的短发夹状RNA （short hairpin RNA, shRNA）序列,并包装成相应的慢病毒,另选择APP基因非特异性siRNA作为阴性对照。Kasumi-1细胞的RNAi实验分为未转染组（Con）、转染APP无关shRNA序列（Lv-shCon）和转染APP特异性shRNA组（Lv-shAPP）三组。慢病毒转染的Kasumi-1细胞经流式细胞术分选出绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）阳性细胞,体外扩增培养。应用荧光定量PCR和western blotting实验检测shRNA对Kasumi-1细胞中APP基因的干扰效果。4.APP基因沉默对Kasumi-1细胞增殖、周期、凋亡、分化和迁移的影响观察APP基因表达稳定沉默对Kasumi-1细胞增殖、周期、凋亡、分化和迁移能力的影响。采用CCK-8法测定三个实验组Kasumi-1细胞的增殖情况；采用AnnexinV-APC/PI凋亡试剂盒检测细胞凋亡率；用碘化丙啶（Prodium Iodide, PI）染色后于流式细胞仪分析细胞周期分布；CD11b-PE单克隆抗体分析细胞分化情况；Transwell小室迁移实验观察细胞的迁移能力变化。5.APP介导Kasumi-1细胞迁移的分子机制研究基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases, MMPs）的主要功能是降解细胞外基质成分,在肿瘤细胞迁移过程中发挥重要作用,其中MMP1、MMP2和MMP9已知与多种肿瘤细胞迁移密切相关。首先用western blotting实验方法检测MMP1、MMP2和MMP9的表达水平,再检测调控MMPs的转录因子c-Myc、Ets1及其上游调控基因ERK、p-ERK的表达水平,初步探讨APP基因介导Kasumi-1细胞迁移的分子信号转导机制。6. Panobinostat干预APP信号传导通路的研究Panobinostat药物以不同浓度作用于Kasumi-1细胞,CCK8法检测药物作用48小时的IC50值。根据药物的IC50值,以不同浓度即5,10,20,40和80nM分别作用Kasumi-1细胞48h后,western blotting实验方法检测APP、p-ERK、c-Myc和MMP2的蛋白表达水平,以明确panobinostat是否能有效干预APP介导的信号传导通路。7.统计学分析所有数据应用SPSS 16.0统计软件进行分析。非正态分布数据用中位数描述,两组间数据比较采用非参Mann-Whitney U检验。组间率的比较用卡方检验（χ2）。采用Kaplan-Meier生存曲线和log-rank检验分析RFS和OS。正态分布数据用均数±标准差描述。多组数据比较,若方差齐用单因素方差（one-way ANOVA）分析,若方差不齐则采用Dunnett’s T3方法进行多重比较。P<0.05判断为差异有统计学意义。结果1.APP基因在AML1/ETO阳性的AML患者BMMNCs中的表达检测44例AML1/ETO阳性的AML患者BMMNCs中APPmRNA的相对表达中位水平为0.009793（0.0000413～0.08367）。以APP基因的mRNA表达中位水平为界,把低于和高于中位表达量的患者分成APP高表达组和APP低表达组各22例,经Mann-Whitney U检验两组APP表达水平差异具有统计学意义（Z=-5.680,P<0.001）。APP高表达组患者中2疗程总CR者18例（81%）,PR或NR者4例（19%）；APP低表达组22例患者均达CR,卡方检验分析提示APP高表达组的CR率显著低于APP低表达组（x2=4.400, P=0.036）。 APP高表达组患者有9例发生髓外浸润,高于APP低表达组的3例髓外浸润患者（χ2=4.125,P=0.042）。截止随访日期,中位随访时间为21月（2-88月）,高表达APP患者的中位OS和RFS分别为16.5和13个月,而低表达APP患者的中位OS和RFS期分别为24.5和22.5个月。APP高表达组OS率和RFS率均低于APP低表达组（54.5%、,S90.9%,x2=7.333, P=0.007; 36.4% vs 77.3%, x2=7-503, P=0.006）。2.慢病毒介导的shRNA对Kasumi-1细胞中APP基因表达的干扰程度Kasumi-1细胞中的APP相对于内参GAPDH的蛋白表达水平（1.3423±0.1152）显著高于HL-60细胞（0.6254±0.0846,P<0.001）和K562细胞（0.8227±0.0974,P<0.001）,由此证实了APP在AML1/ETO阳性的Kasumi-1细胞中高表达。慢病毒转染Kasumi-1细胞72h后,应用流式细胞术无菌分选出Lv-shCon和Lv-shAPP两实验组GFP阳性的细胞并在体外扩大培养,流式细胞术检测Lv-shCon组的细胞GFP阳性率为（96.04±0.17）%、Lv-shAPP组的细胞GFP阳性率为（95.82±0.18）%,提示慢病毒成功转染Kasumi-1细胞。采用qRT-PCR和western blotting实验检测shRNA对Kasumi-1细胞中APP基因表达的抑制程度。QRT-PCR结果示,与Con组（其值设为1）比较,Lv-shCon组的APPmRNA相对于内参β-actin的表达量无显著差异（1.0350±0.0557,95%CI.0.933～1.112）,Lv-shRNA组的APPmRNA相对表达量较Lv-Con组显著减少（0.0116±0.0016,t=31.790,P<0.001）。Western blotting结果示,Lv-shAPP组的APP相对表达量（0.0084±0.0007）较Con组（1.2465±0.0480）及Lv-shCon组（1.2366±0.0421）显著降低（P值均<0.001）,而Lv-shCon组与Con组之间比较差异无统计学意义（P>0.05）。3.APP基因表达抑制对Kasumi-1细胞生物学功能的影响APP基因表达抑制后Kasumi-1细胞在24、48、72和96h时间点的OD450平均值稍低于对照组（Con和Lv-shCon组）,说明细胞的增殖能力轻度受损,然而差异经分析无统计学意义（P>0.05）。流式细胞术分析三组细胞的周期分布情况,发现Lv-shAPP组细胞G0/G1期的比例与Con组比较无显著差异（36.37±3.73、,s 36.25±9.01,P=0.985）,S期和G2/M期的比例分别与Con组比较（28.19±6.08 vs 26.21±5.13, P=0.663; 33.07±2.74 vs 34.25±2.92, P=0.771）,差异均无统计学意义。流式细胞术分析三个实验组细胞的凋亡比例结果示,Lv-shAPP组细胞总凋亡率（即早期和晚期细胞凋亡率之和）平均值稍高于Con和Lv-shCon组。然而,Lv-shAPP组细胞的总凋亡率与Con组和Lv-shCon组比较,差异经统计软件分析均无统计学意义（8.40±0.96% vs 6.80±0.46%, P=0.065; 8.40±0.96% vs 7.10±1.06%, P=0.116）。Lv-shAPP组的Kasumi-1细胞CDllb阳性比例为6.63±0.66%,与Con组（5.69±0.50%）和Lv-shCon组的细胞CDllb阳性率（6.29±0.50%）比较,差异均无统计学意义（P值均>0.05）。采用Transwell小室检测沉默APP表达后细胞体外迁移运动能力的变化,下室细胞计数并计算细胞迁移率。结果发现,Lv-shAPP组下室细胞比例（7.50±0.83%）较对照组显著减少（12.78±2.1%,P=0.004）。结果表明APP基因表达沉默后Kasumi-1细胞的迁移运动能力显著降低,对细胞增殖、凋亡和周期的影响较小。4.APP基因介导Kasumi-1细胞迁移的机制APP基因表达沉默后.western blotting方法检测MMP2的蛋白水平显著减低（P<0.001）,而MMP1和MMP9的表达无显著改变（P值均>0.05）。检测MMPs的上游调控转录因子c-Myc和Etsl的蛋白表达水平发现,与Con组的c-Myc表达水平（0.7024±0.0179）和Etsl的表达水平（0.1035±0.0177）比较,Lv-shAPP组的c-Myc蛋白水平显著下调（0.0896±0.0160,P<0.001）,而Etsl的表达水平无显著改变（0.0996±0.0097,P=0.727）。其中Lv-shCon和Con组比较,c-Myc和Etsl的表达水平差异均无统计学意义（P值均>0.05）。进一步检测c-Myc的上游调控基因p-ERK和ERK的表达变化,结果发现与Con组的p-ERK表达水平（0.1666±0.0162）比较,Lv-shAPP组的p-ERK蛋白水平显著下调（0.0183±0.007,P<0.001）,三组细胞的ERK表达水平相互比较,差异均无统计学意义（P值均>0.05）。5. Panobinostat抑制APP信号通路Panobinostat（PS）对Kasumi-1细胞的抑制作用呈浓度和时间依赖性,对Kasumi-1细胞作用48h的IC50浓度为20nM。Panobinostat以不同浓度5、10、20、40和80nM分别作用Kasumi-1细胞48h,Western blotting检测结果示APP、 p-ERK、c-Myc和MMP2的表达水平均随着panobinostat浓度的增加而下调,呈浓度依赖性。说明Panobinostat能够有效抑制APP基因的表达,从而干预APP介导的信号通路。另外,panobinostat抑制APP基因表达的药物浓度,同时能显著抑制Kasumi-1细胞增殖、诱导细胞凋亡和导致细胞坏死。结论1.AML1/ETO阳性AML患者中,APP基因高表达组的髓外浸润发生率显著高于低表达组,且CR率、OS率和RFS率均显著低于APP基因低表达患者,同时OS期和RFS期也显著短于APP基因低表达组。提示APP基因高表达是一个AML1/ETO阳性的AML患者预后不良的因素。2.慢病毒介导的APP特异性shRNA序列能有效地稳定抑制Kasumi-1细胞的APP基因表达,APP基因表达稳定抑制能显著减弱Kasumi-1细胞的体外迁移能力,而无显著抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡和阻滞细胞周期的效应。3.APP基因表达抑制后检测到MMP2、c-Myc和p-ERK的蛋白水平显著减低,说明APP基因可能通过ERK信号通路介导Kasumi-1细胞的迁移能力。因此,APP/ERK/c-Myc/MMP2信号通路可能是APP基因调控AML1/ETO阳性的白血病细胞的迁移机制之一。4.组蛋白去乙酰化酶抑制剂panobinostat作用能显著下调Kasumi-1细胞中的APP、p-ERK、c-Myc和MMP2的表达水平,呈浓度依赖性,说明panobinostat能够有效抑制APP基因的表达,从而干预APP介导的信号通路。Panobinostat抑制APP信号通路的药物浓度能显著抑制Kasumi-1细胞增殖、诱导细胞凋亡和导致细胞坏死,可能是AML1/ETO阳性白血病患者治疗的有效药物。