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目的:建立一种新型的工艺路线，将蛋白复性与蛋白PEG修饰整合为一步，即同步复性与修饰，从而一步从包涵体蛋白得到高修饰率、高特异性、高纯度的PEG修饰蛋白，改善传统蛋白复性与PEG化学修饰步骤繁琐的缺陷。 方法:配制不同浓度的溶菌酶(20mM PB，pH7.0)溶液，RP-HPLC测定各溶液的洗脱峰。以溶菌酶浓度为横坐标，洗脱峰面积为纵坐标，建立溶菌酶的标准曲线。精密称取25mg溶菌酶加入到2.5ml的蛋白变性液中(20mM PB，8M尿素，100mM DTT，pH7.0)使其终浓度为10 mg/mL，室温放置4h待其变性。通过RP-HPLC确定其变性完全后用PD脱盐柱将溶菌酶中的DTT脱除;变性后的溶菌酶加入到含PEG的复性缓冲液中(4 mM EDTA，1 mM GSSG，10 mM GSH，1.5 Murea，pH6.0，30mM NaBH3CN)，分别在2、4、8、12和24h取样待测，取样后加入2％甘氨酸终止反应。通过12％ SDS-PAGE与RP-HPLC来摸索同步复性修饰的最佳反应条件并详细分析同步复性修饰的具体过程。我们对影响蛋白复性与液相PEG修饰反应的2个主要参数:即反应过程中缓冲液的pH值和反应时间进行了优化。IEC（离子交换色谱）分析不同反应时间的同步复性与修饰产物，运用溶菌酶标准曲线与RP-HPLC分析同步复性与修饰过程中复性率和修饰率随时间的变化，反应结束后用无盐缓冲液将修饰蛋白混合液上样到预先平衡的离子交换色谱柱(IEC)，上样流速为0.5 mL/min，上样结束后用无盐缓冲液冲下未与柱结合的杂质，然后分别用含0.2 M NaCl与1.0 M NaCl的缓冲液将未修饰的溶菌酶与修饰后的溶菌酶依次洗脱下来。运用MALDI-TOF质谱测定修饰产物的分子量;CD圆二色谱对比野生溶菌酶与PEG-LYS的二级结构是否存在差异;融壁微球菌检测溶菌酶同步复性修饰后的活性变化。 结果:以溶菌酶为模型蛋白实施同步复性与修饰，SDS-PAGE结果说明一步法成功的对溶菌酶进行聚乙二醇修饰，通过RP-HPLC证明了同步复性与修饰所得PEG修饰率与天然溶菌酶修饰率基本一致;采用IEC分析不同反应时间同步复性与修饰所得产物，结果表明在此过程中蛋白复性和蛋白PEG修饰同步完成。RP-HPLC对比分析野生型溶菌酶/复性溶菌酶/天然溶菌酶修饰和同步复性与修饰所得溶菌酶，结合溶菌酶标准曲线计算未修饰复性溶菌酶和修饰溶菌酶含量随时间的变化，由RP-HPLC结合溶菌酶标准曲线作图可以看出在反应进行8h之前，复性溶菌酶和PEG修饰溶菌酶的含量均随着时间在增加;反应时间超过8h后，PEG修饰溶菌酶含量依然升高，复性溶菌酶含量降低，这可能是由于蛋白复性接近饱和，先前累积的复性溶菌酶转化为PEG修饰溶菌酶。结果证实同步复性与修饰方法在不影响其复性率的同时，确实同步完成了溶菌酶的复性以及其PEG修饰。MALDI-TOF质谱和圆二色谱对PEG-LYS进行结构表征，MALDI-TOF质谱的结果表明PEG-LYS的分子量为35754Da，提示只有一个PEG分子修饰到蛋白表面;CD结果显示PEG-LYS与野生蛋白的紫外吸收趋势相同，这表明PEG修饰过程对蛋白的空间结构基本上无影响。融壁微球菌对PEG-LYS的活性测试也显示出IPPR得到的修饰蛋白与野生型溶菌酶修饰得到的PEG-LYS活性相差无几。 结论:对于溶菌酶而言，该思路能够在不影响蛋白复性效率的同时，完成蛋白复性与PEG修饰这两个过程。