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伪狂犬病(PR)是多种动物共患的传染病;其病原体伪狂犬病病毒(PRV)是一种猪的疱疹病毒,分类学命名为猪疱疹病毒I型(Suid herpesvirus1)。猪是PRV的传染源和自然贮存宿主,感染后表现为发热、仔猪神经症状和高死亡率、大中猪出现呼吸道症状等临床特征。消化道、呼吸道、精液、胎盘及空气等是PRV的主要传播途径。PRV对于口鼻部呼吸道的上皮细胞具有非常强的嗜性;其基因组是大小约为150kb的线性双链DNA,编码70-100余种蛋白。2011年底,在河北、河南、山东、山西等多个省份许多使用Bartha-K61疫苗免疫猪场爆发了疑似PR的疫病,发病猪出现高温(40-42°C)、食欲不振、咳嗽、腹泻并伴随有系统性神经症状,新生仔猪死亡率高;病毒分离等实验证实引起这场疫病爆发的源头是变异的PRV病毒,这对PR的防控提出了严峻挑战。因此本研究对河南省及周边部分省份PRV的流行进行了血清学调查和分子进化分析;表达了PRV新流行毒株的gE蛋白和gB蛋白并制备了单抗,以期建立的PRV抗原抗体ELISA检测方法和制备的胶体金快速检测试纸能在PRV鉴别诊断和免疫抗体水平评价等方面发挥作用。血清流行病学分析结果表明河南省PRV gE抗体阳性率在2012年升高至38.0%,2013年仍居高不下(31.3%)。种猪群阳性率为36.3%,育肥后期(19-25周龄)阳性率高达59.3%,后备种猪阳性率为23.8%。在2013年检测的347个猪场中,猪场阳性率为83.6%,其中豫北猪场阳性率最高为93.8%。这些数据表明PR在河南省呈严重流行态势。基于分离的12株PRV新流行株的gE、gB和gC基因开展的分子进化分析显示新流行株处于独立的进化分支,与国内早期PRV分离株和其它新流行株进化关系较近,与Bartha疫苗株进化关系较远。为建立针对PRV新流行毒株抗体检测的ELISA方法,我们表达了PRV新流行株(汤阴株)的gE蛋白和gB蛋白。其中gE蛋白为可溶表达,gB蛋白为包涵体表达;利用Ni-NTA亲和层析和离子交换纯化的gE蛋白和gB蛋白分别建立了gE抗体检测的间接ELISA(gE-ELISA)和gB抗体检测的间接ELISA(gB-ELISA)方法。gE-ELISA与商品化试剂盒gpI-ELISA(IDEXX)的符合率为88.76%;特异性(DSP)为79.15%;敏感性(DSN)为94.03%。gB-ELISA与商品化试剂盒gB-ELISA(IDEXX)的符合率为93.14%;DSP为77.78%;DSN为93.64%。在检测的66个阳性场中,阳性活跃场占95.5%,阳性稳定场占4.5%。在PRV gE抗体阴性样品中,gB抗体阳性率占到了94.9%。制备了针对gE蛋白和gB蛋白上具有免疫优势的表位的单抗并建立了单抗阻断ELISA检测方法。gE单抗阻断ELISA(blocking gE-ELISA)与商品化试剂盒gpI-ELISA的符合率为94.10%;DSP为89.90%;DSN为96.18%。gB单抗阻断ELISA(blocking gB-ELISA)与商品化试剂盒gB-ELISA的符合率为94.07%;DSP为85.37%;DSN为95.90%;两种单抗阻断ELISA较间接ELISA在符合率、特异性和敏感性三方面性能均有所提高。在检测的72个阳性场中,阳性活跃场占95.8%,阳性稳定场占4.2%。在PRV gE抗体阴性样品中,gB抗体阳性率占到了98.0%,与间接ELISA结果相符合;说明各个猪场采用的常规疫苗免疫诱导产生了gB抗体,并能够在一定程度上预防PRV的感染或流行。同时我们利用gE蛋白或gB蛋白高免猪血清IgG及特异性单抗酶标物,以NP-40处理的PRV病毒抗原为检测靶标建立了双抗体夹心ELISA并制备了胶体金快速检测试纸。以gE高免猪血清IgG建立的夹心ELISA和试纸均只与PRV野毒抗原反应,不与gE缺失疫苗株和正常BHK-21细胞对照反应;可检测到的病毒样品的最低检测限约为105.0TCID50/0.1mL左右。以gB高免IgG建立的夹心ELISA和试纸可同时与PRV野毒抗原和gE缺失的疫苗株反应,不和正常BHK-21细胞对照反应。本研究中的血清和分子流行病学调查将为河南省PRV的流行和进化关系提供参考;建立的间接和单抗阻断ELISA可用于区分疫苗免疫抗体与野毒感染抗体,并为PRV疫苗免疫抗体水平评价提供手段;建立的检测PRV病毒抗原的双抗体夹心ELISA和制备的胶体金快速检测试纸能够直观简便地进行PRV野毒感染的检测和疫苗质量评估。因此,本研究为我国PR的净化提供了抗原、抗体快速检测的方法。