目的:通过观察重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)模型大鼠肠组织中紧密连接蛋白Occludin-1、ZO-1和分泌型磷脂酶A2(secreted phospholipase A 2,s PLA2)表达的变化规律,来探讨重症急性胰腺炎时,因上皮细胞凋亡和紧密连接断裂引起肠道机械屏障损伤的发生发展与分泌型磷脂酶A2、紧密连接蛋白Occludin-1、ZO-1的关系,分析肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)对紧密连接蛋白的调控通路在肠黏膜机械屏障中的作用,从而进一步探究重症急性胰腺炎时肠道屏障功能损伤的发病机理,探讨中医通里攻下理论在重症急性胰腺炎时肠道屏障功能损伤发病机制中的作用,同时观察祖国传统中药清胰汤(Qingyitang)、临床常规抗炎药物地塞米松(Dexamethasone)、MLCK抑制剂ML-7和树突细胞(dendritic cells,DC)对肠黏膜上皮细胞凋亡、紧密连接结构变化、炎症因子表达水平的影响,探讨中药清胰汤对重症急性胰腺炎相关肠道机械屏障损伤的保护作用,为临床工作中有效提高重症急性胰腺炎及其肠道损伤的治疗效果提供理论指导和实验依据。方法:实验一:采用经十二指肠大乳头开口处沿胆胰管内逆行注射1.5%去氧胆酸钠模拟胆源性胰腺炎的方法建立sap大鼠模型。128只体质量为180~220g健康雄性spf级(spraghe-dawley,sd)大鼠,随机分为4组:假手术(shamoperation,so)组、重症急性胰腺炎(sap)模型组、清胰汤(qingyitang,qyt)干预组、地塞米松(dexamethasone,dex)干预组。其中,so组仅在打开腹腔后轻翻胰腺1~2次后关腹,sap模型组采用去氧胆酸钠胆胰管内逆行注射建立sap大鼠模型,qyt干预组在制备sap大鼠模型前0.5h、后6h和12h给予中药制剂清胰汤灌胃,dex干预组在制备sap大鼠模型后立即、后6h和12h经尾静脉注射地塞米松进行干预,地塞米松给药剂量:l0mg/kg,浓度:5mg/ml。各组实验动物造模后2h、6h、12h、24h每一时间点每组随机选取8只大鼠,用10%水合氯醛腹腔注射麻醉,留取血液和组织标本,观察胰腺和肠组织病理改变,上皮细胞间紧密连接变化情况,测定血清淀粉酶、内毒素、tnf-α的含量。在造模24h后应用tunel-fitc法检测大鼠肠黏膜上皮细胞凋亡情况,应用real-timepcr法检测大鼠肠黏膜紧密连接蛋白occludin-1mrna、zo-1mrna和spla2mrna基因表达。应用westernblot法检测肠组织中紧密连接蛋白occludin-1、zo-1和spla2的表达。实验二:分为动物模型和细胞实验两部分。动物模型部分,48只健康雄性spf级sd大鼠,随机分为:假手术组、模型组、清胰汤干预组和肌球蛋白轻链激酶抑制剂ml-7(剂量:lmg/kg,浓度:1mg/ml)干预组。各组大鼠造模24h后麻醉,留取血液和组织标本,应用elisa法(酶联免疫吸附测定法)检测大鼠血清中内毒素、tnf-α等含量,应用免疫荧光法定位检测肠黏膜紧密连接蛋白occludin-1、zo-1和肌球蛋白轻链激酶(mlck)的表达,应用westernblot法检测肠黏膜上皮细胞紧密连接蛋白occludin-1、zo-1和肌球蛋白轻链激酶(mlck)的表达水平。细胞实验部分,选用人肠黏膜上皮细胞株caco2,以100ng/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml的不同浓度脂多糖(lps)刺激肠黏膜上皮细胞,制备肠黏膜上细胞损伤模型,并于刺激后48h检测炎症因子表达水平,应用westernblot法检测肠黏膜上皮细胞紧密连接蛋白occludin-1、zo-1和肌球蛋白轻链激酶(mlck)的表达水平,并最终选取1μg/mllps刺激48h后的上皮细胞为损伤模型,设立空白对照组,采用激光扫描共聚焦显微镜检测肠黏膜上皮细胞骨架结构变化,同时观察中药单体大黄素(40μm)和肌球蛋白轻链激酶抑制剂ml-7(10μm)的干预作用。实验三:采用lps刺激人肠黏膜上皮caco2细胞株,建立肠黏膜上皮细胞损伤模型,分为空白对照组、lps刺激组、10%树突细胞干预组(树突细胞与caco2细胞共培养比值为1:10)、5%树突细胞干预组(树突细胞与caco2细胞共培养比值为1:20)、2.5%树突细胞干预组(树突细胞与caco2细胞共培养比值为1:40)。造模48h后,应用液相芯片法检测炎症因子表达水平,应用westernblot法检测肠黏膜上皮细胞紧密连接蛋白occludin-1、zo-1和肌球蛋白轻链激酶(mlck)的表达水平,采用激光扫描共聚焦显微镜检测肠黏膜上皮细胞骨架结构变化,分析树突细胞的干预作用。结果(1)对比假手术组,sap模型组大鼠血清内毒素、tnf-α和淀粉酶含量、肠组织中spla2、mlck蛋白含量均明显增高,肠组织中紧密连接蛋白occludin-1、zo-1含量明显减少,胰、肠组织出现明显损伤,肠黏膜上皮细胞间紧密连接间隙增宽,肠黏膜上皮细胞凋亡量升高(p<0.01)。对比sap模型组,清胰汤、地塞米松、ml-7三组药物干预后的大鼠血清内毒素、tnf-α、淀粉酶含量、肠组织中spla2、mlck蛋白含量均明显减少,肠组织中紧密连接蛋白occludin-1、zo-1含量明显增高,胰、肠病理损伤较轻,肠黏膜上皮细胞间紧密连接结构损伤减轻,肠黏膜上皮细胞凋亡相对减少,具有显著的统计学意义(p<0.05)。(2)与对照组相比,lps刺激组caco2细胞mlck含量明显增高(p<0.05),细胞间紧密连接蛋白occludin-1、zo-1含量明显减少(p<0.05),细胞骨架结构损伤明显,以lps刺激48h后的肠黏膜上皮细胞损伤最为显著。与lps刺激组相比,ml-7干预组caco2细胞mlck含量明显减少(p<0.05),细胞间紧密连接蛋白occludin-1、zo-1含量明显增加(p<0.05);大黄素干预组炎症因子il-1β、ifn-γ表达明显减少,细胞骨架结构损伤减轻,但紧密连结蛋白含量较lps刺激组并无明显改变。与lps刺激组相比,10%树突细胞干预组caco2细胞间紧密连接蛋白occludin-1、zo-1含量明显增加(p<0.05),mlck含量明显减少(p<0.05)。结论:(1)在胆胰管内逆行注射去氧胆酸钠溶液制备胆源性重症急性胰腺炎大鼠肠道屏障损伤模型稳定,模型组大鼠血清内毒素、tnf-α等炎症结果因子含量在短时间内(2h)显著升高,胰腺和肠组织发生明显损伤。(2)SAP时,肠组织中s PLA2表达增高,促进肠黏膜上皮细胞凋亡,在肠黏膜机械屏障损伤中起重要作用。(3)SAP时,高表达的MLCK下调紧密连接蛋白Occludin-1、ZO-1的表达,导致紧密连接间隙增宽,在肠黏膜机械屏障损伤中均起重要作用。(4)地塞米松可以抑制血清内毒素、TNF-α的过量表达。ML-7能抑制MLCK的过度表达。清胰汤可以通过促进肠蠕动、降低肠道通透性、减少肠道内细菌移位的作用,防治SAP相关肠道屏障损伤,其可以和西药相辅相成的发挥对肠道屏障功能的保护作用。(5)树突细胞可以通过免疫调节,提高紧密连接蛋白Occludin-1、ZO-1的表达。