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第一部分:HMGB1刺激Kupper细胞后功能变化目的:观察HMGB1刺激后Kupffer细胞(KCs)吞噬功能、膜蛋白表达及分泌功能变化。方法:分离大鼠KCs,鉴定KCs的纯度,判断KCs的活性及吞噬功能。将分离、纯化的KCs以每孔3-4×106接种于培养板中,随机分为2组:(1)HMGB1刺激组:给予500ng/ml HMGB1刺激;(2)对照组:给予PBS刺激。分别在处理24小时后收获细胞。吞墨实验检测KCs吞噬功能。流式细胞术检测KCs膜蛋白表面分子F4/80,CD206表达情况。Western blot法检测Arg-1,VEGF,TGF-β,MMP-9等蛋白表达水平。ELISA法检测细胞培养上清液中IL-6,IL-8,IL-10分泌情况。Transwell小室法检测共培养Walker256侵袭及迁移能力变化。重复上述检测。结果:(1)所提取KCs纯度大于91.0%,活力均在97.8%以上;(2)HMGB1组KCs M2表型表面分子CD206明显高于对照组,Arg-1酶活性表达明显高于对照组(P<0.05)。HMGB1组细胞培养上清液IL-6水平明显低于对照组;IL-10水平明显高于对照组(P<0.05)。HMGB1组Arg-1,TGF-β,MMP-9蛋白水平显著高于对照组(P<0.05);VEGF蛋白水平及IL-8分泌量差异不明显(P>0.05)。(3)HMGB1组共培养Walker256侵袭及迁移能力均显著高于对照组(P<0.05)。结论:HMGB1可激活KCs向M2表型极化,表现为吞噬功能下降,膜表达CD206增加,TGF-β、MMP-9蛋白表达增加,IL-10分泌升高,IL-6分泌减少,增强共培养大鼠肝癌细胞株迁移及侵袭能力。第二部分:抑制TREM-1对HMGB1诱导Kupffer细胞向M2型极化的影响目的:观察特异抑制TREM-1后HMGB1刺激KCs细胞膜蛋白表达、吞噬功能及分泌功能变化。方法:将获取的KCs以每孔3-4×106接种于培养板中,并随机分为4组:(1)HMGB1组(500ng/ml,HMGB1);(2)LP17+HMGB1组(100μmol/L,LP17+500ng/ml,HMGB1);(3)sh RNA-TREM-1+HMGB1组(sh RNA-TREM-1+HMGB1);(4)sh RNA-NC+HMGB1组(sh RNA-NC+HMGB1)。荧光显微镜鉴定转染效果。分别在处理后24小时收获细胞。流式细胞术检测KCs膜蛋白表面分子F4/80,CD206表达情况。Western blot法检测VEGF,TGF-β,MMP-9等蛋白表达水平。ELISA法检测细胞培养上清液中IL-6,IL-8,IL-10分泌情况。Transwell小室法检测共培养Walker256侵袭及迁移能力变化。重复上述检测。结果:(1)转染sh RNA-TREM-1 24h后仅有少量绿色荧光蛋白表达,48h后绿色荧光蛋白表达明显增加,72h后达高峰,转染率达83%。(2)HMGB1组、sh RNA-NC+HMGB1组KCs膜蛋白CD206比例显著高于LP17+HMGB1组、sh RNA-TREM-1+HMGB1组(P<0.05)。HMGB1组及sh RNA-NC+HMGB1组TGF-β、MMP-9蛋白表达水平显著高于LP17+HMGB1组、sh RNA-TREM-1+HMGB1组(P<0.05);LP17+HMGB1组与sh RNA-TREM-1+HMGB1组间无显著性差异(P>0.05),HMGB1组与sh RNA-TREM-1+HMGB1组间无显著性差异(P>0.05)。HMGB1组IL-6水平明显低于LP17+HMGB1组及sh RNA-TREM1组,差异具有统计学意义(P<0.05);而与sh RNA-NC组无显著性差异(P>0.05)。HMGB1组IL-10蛋白水平(528.6±14.3pg/ml)明显高于LP17+HMGB1组及sh RNA-TREM1组,(P<0.05);而与sh RNA-NC组,但差异不明显(P>0.05)。(3)HMGB1组共培养Walker256迁移力和侵袭显著高于LP17+HMGB1组和sh RNA-TREM1组(P<0.05);而与sh RNA-NC组无显著性差异(P>0.05)。结论:HMGB1可引起KCs向M2型极化;沉默或特异性拮抗KCs TREM-1可阻断该作用。提示HMGB1是通过结合KCs上TREM-1发挥胞内信号传导作用的。第三部分:JAK-STAT信号通路在HMGB1/TREM-1激活Kupffer细胞向M2型极化中的作用目的:研究JAK-STAT信号通路在HMGB1/TREM-1诱导KCs向M2型极化中的作用。方法:选取2014年6月至2015年2月到重庆医科大学附属第二医院就诊的HCC行HIFU治疗后患者145例。根据纳入及排除标准,入组HCC行HIFU治疗后患者15例,设立15例健康对照人群,测定外周血HMGB1及s TREM1水平。免疫组化法检测3例HCC行HIFU治疗后再手术切除病灶的肿瘤组织及癌旁组织中HMGB1、TREM-1、DAP12、STAT6、PPARg表达情况。将获取的大鼠KCs以每孔3-4×106接种于培养板中,随机分为以下四组:(1)HMGB1组:(500ng/ml,HMGB1);(2)LP17+HMGB1组:(100μmol/L,LP17+500ng/ml,HMGB1);(3)HMGB1+GW9662组:(25μmol/L,GW9662+HMGB1);(4)对照组(Control组)。各组于处理24h后收获细胞。流式细胞术检测膜蛋白表面分子F4/80,CD206表达情况;Western blot检测DAP12、STAT6、VEGF、TGF-β、MMP-9蛋白表达水平变化;ELISA检测细胞上清液中IL-6、IL-8及IL-10的含量变化。重复上述检测。结果:(1)HCC组外周血HMGB1及s TREM1水平显著高于健康人群组(P<0.05)。(2)与癌旁组织相比较,肿瘤组织内HMGB1、TREM1、DAP12、STAT6及PPARγ表达均明显增高(P<0.05)。(3)体外细胞实验HMGB1组细胞培养上清液IL-10水平显著高于LP17+HMGB1组、Control组及GW9662+HMGB1组(P<0.05);IL-6水平显著低于LP17+HMGB1组、Control组及GW9662+HMGB1组(P<0.05)。流式细胞检测结果显示:HMGB1组KCs膜蛋白CD206比例显著高于LP17+HMGB1组、GW9662+HMGB1组及Control组(P<0.05)。HMGB1组、GW9662+HMGB1组DAP12蛋白表达量均显著高于Control组、LP17+HMGB1组(P<0.05);HMGB1组DAP12蛋白表达量稍高于GW9662+HMGB1组,但差异不明显(P>0.05);Control组、LP17+HMGB1组DAP12蛋白表达量,但差异不明显(P>0.05)。HMGB1组、GW9662+HMGB1组STAT6蛋白表达量显著均高于Control组、LP17+HMGB1组(P<0.05);HMGB1组STAT6蛋白表达量高于HMGB1组STAT6蛋白表达量高于GW9662+HMGB1组,但差异不明显(P>0.05);Control组、LP17+HMGB1组STAT6蛋白表达量,但差异不明显(P>0.05)。HMGB1组MMP-9、TGF-β蛋白表达量显著均高于Control组、LP17+HMGB1组及GW9662+HMGB1组(P<0.05);Control组、LP17+HMGB1组及GW9662+HMGB1组三组间MMP-9、TGF-β蛋白表达量,但差异不明显(P>0.05)。结论:(1)肝癌HIFU治疗后外周血存在HMGB1及s TREM1蛋白水平显著升高;癌组织中HMGB1、TREM1、DAP12、STAT6及PPARγ较癌旁组织表达明显增高;(2)刺激KCs 24小时后,KCS向M2型极化;LP17,GW9662可明显抑制HMGB1的刺激作用。(3)HMGB1与TREM-1结合,是通过JAK-STAT6途径激活PPARg,引起KCs向M2型极化。