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背景阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种会引起记忆力下降和认知能力受损的神经退型性病变。其主要的组织病理特点是Aβ(amyloid-β)斑块沉积,神经纤维缠结形成和神经元丢失以及伴随有神经炎症。大量文献报导神经炎症是AD发生的罪魁祸首。神经胶质细胞的异常激活会引起促炎因子释放,比如IL-1β和TNF-α,研究显示在动物模型中这些促炎因子反过来又会加强APP的表达和Aβ的形成。Aβ主要沉积在海马和皮层中,并给这些区域带来损害,造成神经退变。二甲双胍是一种一线降糖药物,具有抗炎和免疫抑制功效。其抗炎作用在体内、外等多种实验模型中均有报道。二甲双胍是一种AMPK的激活剂。据报道AMPK激活能够抑制Aβ沉积,改善线粒体功能和抑制氧化应激,在小鼠大脑中发挥着有益的作用。研究显示二甲双胍能改善AD相关的神经病理改变和降低认知功能损伤,然而,也有报道表明二甲双胍的使用会加重Aβ沉积,更有趣的是,有研究显示,二甲双胍对雄性小鼠有害而对于雌性小鼠有益。这提示我们或许性别是一个重要的因素,在处理阿尔茨海默疾病上。此外,二甲双胍能够改善Aβ引起的原代海马神经元凋亡,具有神经保护作用。多个研究发现Aβ斑块周围围绕着胶质细胞。也有报道表明二甲双胍能够加强小胶质细胞的吞噬作用通过依赖AMPK的方式。APP/PS1双转基因小鼠能很好的模拟阿尔茨海默病,其海马和皮质区可见淀粉样斑块形成,其认知能力显著下降。因此,该模型被广泛应用于阿尔茨海默病的研究中,然而,二甲双胍对于该模型的作用仍然未知。目的二甲双胍是否有效减弱炎症反应和改善APP/PS1小鼠的认知功能,并初步探讨其作用机制。方法第一部分:利用水迷宫实验检测各组小鼠学习记忆情况,之后,用免疫组织化学染色及ELISA实验观察各组小鼠脑内Aβ表达情况。第二部分:Western Blot检测NeuN蛋白的表达,利用免疫组织化学方法检测BRDU,NeuN,DCX等来观察神经发生情况,利用Tunnel试剂盒检测海马区神经凋亡情况。第三部分:Western Blot及RT-qPCR检测炎症因子表达情况,免疫组织化学法观察海马和皮层胶质细胞形态和数目及其与Aβ之间的位置关系。第四部分:Western Blot检测通路蛋白表达情况,免疫组织化学法观察海马区各类细胞与AMPK之间的关系。结果第一部分:在水迷宫试验中,结果显示:APP/PS1小鼠表现出了明显的空间学习能力损伤与WT小鼠相比。然而,二甲双胍处理组APP/PS1小鼠的潜伏期与APP/PS1模型小鼠潜伏期比较,随着训练天数的增加明显缩短。另外,三组小鼠的游泳速度在试验期间没有明显差异。这些结果表明二甲双胍处理能够改善APP/PS1小鼠空间学习能力的损伤。与WT组小鼠相比,APP/PS1小鼠在目标象限搜索的时间更少,穿越平台次数也更少。然而,与APP/PS1小鼠相比,二甲双胍处理后的APP/PS1小鼠则显著增加目标象限的搜索时间和穿越平台的次数。免疫组化结果显示APP/PS1小鼠海马和皮层中Aβ40和Aβ42覆盖面明显高于WT组小鼠。二甲双胍处理的APP/PS1小鼠海马和皮层中Aβ40和Aβ42阳性斑块明显减少了,与APP/PS1模型鼠相比。ELISA实验结果显示:APP/PS1小鼠中可溶性Aβ40和Aβ42蛋白明显高于WT组小鼠。二甲双胍处理后海马和皮层中可溶性Aβ40和Aβ42蛋白含量明显减少。第二部分:免疫组化结果显示:与APP/PS1组小鼠相比,二甲双胍处理后海马中的NeuN阳性细胞数明显增多,同时,WB结果也显示二甲双胍处理后的APP/PS1鼠海马中的NeuN蛋白表达量明显增高于APP/PS1组。与上述结果一致的是,TUNEL实验结果也显示二甲双胍能够明显减少APP/PS1小鼠海马CA1区的神经细胞凋亡。这些结果表明二甲双胍对APP/PS1小鼠海马中的神经元细胞具有保护作用。BRDU和DCX标记结果显示二甲双胍处理组小鼠海马齿状回中BRDU和DCX阳性细胞明显多于APP/PS1模型组。第三部分:免疫组化结果显示:与WT组相比,APP/PS1小鼠海马和皮层中能观察到更强的活化的星形胶质细胞和小胶质细胞。而且,在二甲双胍处理的APP/PS1小鼠海马和皮层中活化的星形胶质细胞和小胶质细胞增生受到抑制。为了观察围绕在Aβ斑块周围的活化的小胶质细胞和星形胶质细胞,我们用Iba1或者GFAP和Aβ进行双标,结果发现在APP/PS1小鼠大脑中Aβ周围聚集了大量活化的星形胶质细胞和小胶质细胞,然而,二甲双胍处理组则相对减少。这些结果表明二甲双胍能有效降低小胶质细胞和星形胶质细胞的活化。我们的ELISA结果显示与WT组相比,APP/PS1模型组的海马和皮层中IL-1β和TNF-α的表达量明显增多,而IL-4则无明显变化。有趣的是,二甲双胍处理组海马和皮层中IL-1β和TNF-α戏剧性地减少,而IL-4则有所增加。我们的RT-qPCR结果也与ELISA结果一致。第四部分:WB结果显示与WT对照组小鼠相比,APP/PS1小鼠海马中p-AMPK明显减少。然而,p-mTOR,p-S6K,p-P65NFκB和Bace1的蛋白表达则增多。值得注意的是,二甲双胍处理后APP/PS1小鼠海马中的p-AMPK的表达量明显增高而p-mTOR,p-S6K,p-P65NFκB和Bace1则降低,这些结果提示这些蛋白的改变可能与二甲双胍的神经保护作用有关。免疫荧光观察到的结果与WB结果一致,p-AMPK在APP/PS1小鼠海马中的表达相对较少,然而,二甲双胍处理的APP/PS1小鼠海马中则增多,且p-AMPK染色位于Iba1阳性小胶质细胞和GFAP阳性星形胶质细胞中。结论1)二甲双胍减少Aβ沉积并改善APP/PS1小鼠空间学习记忆损害。2)二甲双胍促进APP/PS1小鼠海马神经发生,阻止神经细胞凋亡。3)二甲双胍抑制APP/PS1小鼠神经炎症。4)二甲双胍可能通过AMPK/mTOR信号发挥神经保护作用和AMPK/P65NFκB信号发挥抑制炎症作用。