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赖草(Leymus secalinus)是赖草属多年生根茎禾草,无性繁殖能力强,不仅抗逆能力强,且营养价值丰富,是盐碱地生物改良的优质牧草。本研究用NaCl(0、100、200、300、400、500、600、700 mM)、NaHCO3及Na2CO3(0、50、75、100、150、200、300、400 mM)对盆栽赖草幼苗进行胁迫,通过幼苗的生长特性、生理生化、光合荧光、叶肉细胞超微结构等指标分析并探讨了盐碱胁迫对赖草幼苗的伤害和幼苗的抗盐碱能力及机制。同时,克隆了一个Ca2+介导的启动胁迫响应途径的中间基因CDPK(钙依赖蛋白激酶)。为分子水平解释赖草的抗盐碱机制奠定了基础,并为赖草耐盐新品种的驯化选育提供了理论依据。主要研究结果如下：1盐碱胁迫对赖草幼苗生长及生理生化特性的影响(1)赖草叶片相对含水量和生长速度与盐碱浓度呈负相关,Na2CO3胁迫下生长速度降低最为明显(0.59 cm·d-1),其次为NaHCO3 (0.34 cm-d’1),NaCl最小(0.29 cm·d-1)。赖草幼苗的根冠比(R/T)与盐碱浓度呈正相关,随盐碱浓度的增加,R/T增加的速度是Na2CO3大于NaHCO3大于NaCl。(2)赖草幼苗的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性均随盐碱浓度的增加呈现出先增加后降低的趋势,在NaCl 400 mM. NaHCO3 150 mM、Na2CO3浓度100-150mM时,SOD与POD的值达最大。丙二醛(MDA)则是随盐碱浓度的升高在增加。(3)脯氨酸(Pro)、可溶性糖和甜菜碱(BADH)均随盐碱浓度的增加呈现出先增加后降低的趋势。NaCl胁迫下,Pro在600mM达到最大,BADH和可溶性糖在500 mM达最高值。200--300mM NaHCO3 Pro、BADH和可溶性糖达最大。Na2CO3胁迫后Pro、BADH和可溶性糖均在200 mM达最大。3种渗透物质分别在不同浓度下达到最大,这样能有效地进行渗透调节,这可能是赖草耐盐碱的一个原因。(4)叶绿素(Chl)的含量与光合、荧光作用密切相关,不同盐碱浓度胁迫下赖草幼苗Chl a、Chl b和总Chl含量在高浓度NaCl 500 Mm、NaHCO3 400mM和Na2CO 3300mM显著下降；从而导致了净光合速率(Pn)在高浓度时有所下降,在低浓度盐碱胁迫下没有变化；气孔导度(Gs)在所有浓度下均与CK无差异,水分利用效率(WUE)随浓度升高呈现出先增加后降低的趋势。随胁迫时间的延长赖草幼苗的Pn和WUE在降低,蒸腾速率(Tr)和Gs随胁迫时间的延长先增加后降低,Pn的降低主要是由非气孔因素引起。随NaCl、NaHCO3和Na2CO3浓度的增加,Fo先降后升；Fv/Fm、Fv/Fo则降低,Fv/Fm的值明显下降,分别下降了38%、19%和34%。NPQ是光保护的重要指标,随PAR的增加而增大,在现有的光强范围内,NPQ未达到稳定状态,说明荧光猝灭的原因是热耗散增加。低浓度的胁迫下幼苗由于热耗散存在没有受到伤害,随浓度的增加,受损伤的程度增加。(5)NaCl、Na2CO3禾NaHCO3胁迫后,赖草幼苗根系的Na+含量均高于茎叶的含量,Cl-含量是茎叶高于根系,根系的限Na+能力随盐碱浓度的增加在增大。赖草幼苗在300mM NaCl以下不受影响,Na2CO3浓度低于150mM可以通过K+、Ca2+的协调来抵制Na+和Cl-的积累,NaHCO3浓度高于200 mM茎叶Na+和Cl-含量增加,受胁迫严重。随盐碱浓度的增加,Na/K比增加,但茎叶的增加量小于根系,说明赖草是通过根系限制Na+向茎叶运输,从而避免或减轻Na+对茎叶的损伤。从生长、叶片膜脂的伤害程度、保护酶、光合和离子含量等方面分析,400 mMNaCl以下赖草能正常生长；Na2CO3浓度大于150 mM赖草幼苗会受到影响；幼苗可以忍耐200mM的NaHCO3。2盐碱胁迫对赖草叶片叶肉细胞超微结构的影响低浓度盐碱胁迫(NaCl 100 mM、NaHCO3 50mM和Na2CO3 50mM)对叶肉细胞超微结构影响较小。中等浓度盐碱胁迫(NaCl 400 mM、NaHCO3 150mM和Na2CO3150mM)引起叶肉细胞变化,类囊体间隙增大、基粒片层紊乱,淀粉粒较少,线粒体膜开始解体,嗜锇体有所增加。高浓度盐碱胁迫(NaCl 700 mM、NaHCO3 400mM和Na2CO3400mM)细胞变形、叶绿体双层膜解体,基质外渗、嗜锇体明显增大增多、淀粉粒很少或没有。3赖草LsCDPK基因的克隆和表达应用同源序列引物对盐碱胁迫后的赖草进行RACE克隆,从中克隆了CDPK基因,该基因与二穗短柄草SK5-like基因同源性最高,达到94%,命名为LsCDPK。LsCDPK全长2480bp,编码由520个氨基酸组成的蛋白质,属于膜外蛋白,具有亲水性,定位于细胞核中。LsCDPK基因在赖草不同组织和不同逆境胁迫下的表达特异性,表明LsCDPK基因在整个植株中均能表达,且在根中的表达量最大。赖草中的LsCDPK基因能被盐碱、低温和干旱诱导,初步推测LsCDPK基因至少参与了盐碱、低温和干旱逆境胁迫的响应。