论文部分内容阅读
果糖-1，6-二磷酸醛羧酶（FBAase）是一种双功能酶，它既可以参与光合作用中催化裂解果糖-1，6-二磷酸(FBP)生成磷酸二羟基丙酮(DHAP)以及3-磷酸甘油醛(G3P)的过程，同时它也是该反应逆向发生的合成酶，因此该酶在光合作用的Calvin循环过程中扮演着重要的角色，果糖-1，6-二磷酸醛羧酶根据其催化机理不同分为两类，称为Ⅰ型果糖-1，6-二磷酸醛羧酶和Ⅱ型果糖-1，6-二磷酸醛羧酶。 近几年来，由蓝藻导致的水华给水生态系统的健康发展以及人类的日常生活带来了严重的影响。光合作用是蓝藻生存的基础，而果糖-1，6-二磷酸醛羧酶为光合作用暗反应中必不可少的一种催化酶，因此，如果能通过研究果糖-1，6-二磷酸醛羧酶的酶学性质，进而有针对性地设计以其为靶酶的高效除藻剂就可以从环保的角度出发治理水华现象。大多数蓝藻体内主要含有Ⅱ型果糖-1，6-二磷酸醛羧酶，本论文将以蓝藻Ⅱ型果糖-1，6-二磷酸醛羧酶为研究对象，利用表达纯化、酶动力学等生物方法以及同源模建、分子对接等技术对蓝藻Ⅱ型果糖-1，6-二磷酸醛羧酶的酶学性质进行研究，以便为后续进一步研究研究酶的结构及反应机理，从而开发环境友好、高效、高选择性的绿色除藻剂的潜在作用靶标奠定基础。具体研究内容如下: 1、通过蛋白重组表达技术，以pet3a作为表达载体，选用大肠杆菌BL21为表达菌株，对蓝藻Ⅱ型果糖-1，6-二磷酸醛羧酶进行异源表达，并对表达条件进行优化。通过疏水层析技术对表达得到的粗蛋白进行纯化，从而建立大肠杆菌体内的蓝藻Ⅱ型果糖-1，6-二磷酸醛羧酶的表达体系，目的蛋白纯度达到95％，表达最终产量达到11.9mg/LLB。 2、对蓝藻Ⅱ型果糖-1，6-二磷酸醛羧酶的酶动力学性质进行研究，测定了温度、pH、底物及金属离子等对酶动力学的影响，建立并优化了蓝藻Ⅱ型果糖-1，6-二磷酸醛羧酶的酶活测试体系。 3、对CFL、FB、LH、CH及D13五个系列化合物进行了50μM终浓度条件下的初筛，在筛选的这273个化合物中，D13系列表现出了较高的抑制率，随后对50μM终浓度条件下抑制率大于90％的22个化合物求取其IC50值，发现IC50值最低的为D13-158小分子，其值为870nM。 4、通过同源模建、分子对接等分子模拟技术以梨形鞭毛虫体内的Ⅱ型FBAase的序列为模板构建了蓝藻Ⅱ型-1，6-二磷酸醛羧酶的3D模型，并对D13-158小分子及底物FBP与靶酶的相互作用方式进行初步探索，得到活性空腔中一些可能与金属离子及底物有相互作用的重要氨基酸，这为后续进一步研究靶酶的结构性质奠定了基础。