柑橘果胶的亚临界水法降解及其生物活性研究

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柑橘果胶是从柑橘果皮中提取的一种果胶,相对分子质量较大,对人体没有非常有效的功用,低分子质量柑橘果胶是将天然柑橘果胶经过改性处理后的果胶,是一种新兴的生物活性多糖。为了提高柑橘果胶的利用价值,本文采用100℃-130℃的亚临界水来降解柑橘果胶使之转化为低分子质量果胶,研究改性前后果胶组分、结构的变化,并结合流变学、降解动力学的研究来分析其作用机制。在此基础上,从抗氧化活性、抗肿瘤活性、免疫调节活性及对小鼠肠道菌群的影响四方面研究亚临界水处理对果胶生物活性的影响。主要结果如下:(1)亚临界水对柑橘果胶相对分子质量的影响及其降解动力学:将柑橘果胶溶液置于高压蒸汽灭菌锅中,分别在100℃、110℃、120℃和130℃的温度下处理5 min-100min,研究不同温度的亚临界水处理不同时间对柑橘果胶相对分子质量的影响。发现随着亚临界水温度的升高和处理时间的延长,果胶相对分子质量逐渐减小,数均分子质量最低达23.7 ku,重均分子质量最低达44.5 ku,果胶降解度分别可达80.5%(以数均分子质量计)和71.7%(以重均分子质量计算)。在相同条件下,以数均分子质量计算的降解度高于以重均分子质量计算的降解度。亚临界水对果胶的降解作用符合一级动力学方程,温度越高降解速率常数越大。随着亚临界水温度的升高和处理时间的延长,果胶溶液中还原糖的含量逐渐增高,总糖的水解度介于以数均分子质量计算和以重均分子质量计算的降解度之间,表明三者呈现的果胶降解规律基本一致。(2)亚临界水处理对果胶流变学性质的影响:用流变仪来测量上述不同处理样品的流变特性,用非牛顿流体的幂律方程公式进行拟合。发现随着亚临界水温度的升高和处理时间的延长,果胶溶液的流态特性指数n从0.7919逐渐增加到1.7864,流体类型由假塑性流体变为胀塑性流体。表观黏度随时间变化的数据可用类似于多糖降解的一级动力学方程回归拟合(R2≥0.913),发现亚临界水温度越高表观黏度变化越快。(3)亚临界水处理对果胶结构和组分的影响:选择未处理的柑橘果胶(A)和120℃处理40 min(B)、130℃处理60 min(C)、130℃处理180 min(D)的果胶进行比较研究。发现随着亚临界水温度的升高和处理时间增加,果胶样品相对分子质量下降,分散度(Mw/Mn)增加,鼠李糖和半乳糖含量先下降后升高。光谱分析发现亚临界水处理对柑橘果胶的基本结构未产生明显影响,但会使分子中羟基、羧基含量升高,并发生酯化反应。使果胶的有序结构减少,松弛不规则聚集的无序结构增多,使果胶分子弯曲消失,长宽比缩小,表面积增大,小分子片段增多,并发生褐变反应。综合以上结构分析,发现亚临界水处理可使柑橘果胶分子发生水解,也有通过酯化反应、焦糖化反应重新聚合的可能;亚临界水更多可能通过打断果胶分子中的支链或靠近末端的糖苷键来实现对果胶的降解;经亚临界水处理后,果胶分子发生降解,无序结构增多,更多活性基团暴露出来,可能会呈现更好的生物活性。(4)亚临界水处理对果胶抗氧化活性和抗肿瘤活动的影响:研究了四种不同亚临界水处理所得果胶的DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、还原力及对肿瘤细胞生长的抑制活性。发现随着处理温度的升高和处理时间增加,抗氧化活性逐渐增强。与未处理的果胶相比,经130℃处理180 min后果胶的DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力以及还原力分别提高了4.6-9.7倍、15.5-32.7倍和9.9-19.9倍。与常用的抗氧化剂Vc相比,经130℃处理180 min后果胶的DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力以及还原力分别与浓度为其0.9%-1.5%、9.9%-15.7%和5.0%-17.5%的Vc相当。随着亚临界水温度升高和处理时间的增加,果胶对肿瘤细胞的抑制作用逐渐增强。经130℃处理180 min后果胶对Hep G2细胞、HT-29细胞和SW620细胞增殖(72 h)的半数抑制浓度分别为0.13 mg/m L、0.038 mg/m L和0.026 mg/m L。(5)亚临界水处理对免疫抑制小鼠免疫力和肠道菌群的影响:利用环磷酰胺诱导建立免疫抑制小鼠模型,来评价亚临界水降解(120℃处理40 min)的低分子质量果胶对肠道菌群和免疫机能的调节作用。发现摄食低分子质量果胶有助于免疫抑制小鼠体重的增加,减轻脾脏的萎缩,提高血清和结肠细胞因子浓度,具有增强免疫作用。摄食低分子质量果胶还可以恢复因环磷酰胺处理而改变的小鼠肠道菌群结构,使其接近正常对照组的肠道菌群结构。聚类分析发现喂食低分子质量果胶可使拟杆菌门和厚壁菌门丰度正常化,抑制变形杆菌门丰度的增加;在科、属层面上分析,可使因环磷酰胺处理而改变的细菌相对丰度均逆转至与正常对照组相似水平。免疫抑制小鼠补充低分子质量果胶后可导致菌群功能基因在KEGG代谢途径上的差异,并接近正常对照组。试验发现,经亚临界水处理后的果胶在免疫调节作用上比未处理的柑橘果胶表现出了更好的功能特性和生物活性,是一种潜在的免疫调节剂,可以调节肠道菌群结构,预防和治疗免疫抑制性疾病。
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