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氮元素污染物是造成水体污染和富营养化的主要原因之一。一般认为，生物脱氮要经过硝化作用和反硝化作用两个过程。而自养型硝化细菌在硝化作用过程中占据主要地位。但近来的研究表明,有些异养微生物也能进行硝化作用，如脱氮副球菌（Paracoccus denitrificans）和恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）等。本文新分离得到了一株异养硝化菌LYS-86。根据菌株的形态学和生理生化特性鉴定及16S rDNA的同源性分析结果，将其初步鉴定为Pseudomonas stutzeri。经单因素试验,菌株LYS-86氧化亚硝酸盐的最适pH，温度，转速，盐浓度分别为8.010.0，30℃，180 rpm和1 g/L。当培养基中初始亚硝酸盐浓度为0.5 g/l时，菌株LYS-86的硝化活性最高，随着培养基中初始亚硝基氮浓度的不断提高，菌株LYS-86的硝化活性不断下降。为便于实时监测和考察异养硝化菌LYS-86生物膜的形成与变化情况，需要构建荧光标记菌株。本文首先构建了带有绿色荧光蛋白基因的重组自杀性载体pUT/mini-Tn5-Km2-GFP，再通过该质粒的介导作用将绿色荧光蛋白基因整合到菌株LYS-86的染色体上，以使其获得稳定的荧光表型。实验结果表明pUT/mini-Tn5-Km2-GFP已经构建成功。该质粒上的绿色荧光蛋白基因也能在E.coli S17-λpir中得到了表达。随后通过双亲本滤膜接合作用，在加有适当浓度的卡那霉素的硝化培养基上筛选得到了多株阳性接合子。取其中两株PCR鉴定正确的阳性接合子在荧光显微镜下观察其荧光表型。发现整合进染色体上的绿色荧光蛋白基因并未在这些结合子中获得表达。这可能是由于乳糖启动子在接合子中没有发挥作用从而没有成功启动下游的荧光蛋白基因的表达而造成的。本文同时根据假单胞菌属中amoA基因的两个保守的区域设计了一对简并引物，从另一株异养硝化细菌Pseudomonas putida xyzPCR获得了一条长817bp的基因片段。该基因片段与已报道的菌株Pseudomonas putida F1的amoA基因有较高的同源性，同源性达到了94%。根据菌株Pseudomonas putida F1的amoA基因序列设计了一对特异性引物，PCR获得了一段长1056 bp的基因片段，该基因片段编码351个氨基酸。该基因片段编码的amoA与菌株Pseudomonas putidaF1，Pseudomonas entomophila L48，Pseudomonas fluorescens Pf-5以及Pseudomonas syringae pv.oryzae str. 16的amoA基因在蛋白质水平上的同源性分别为97%，93%，75%和74%，从而可以初步认定已经成功从硝化菌株Pseudomonas putida xyz中克隆获得了硝化途径中的关键酶基因之一：氨单加氧酶基因（amoA），为后续构建基因工程菌奠定了基础。