论文部分内容阅读
背景及目的:肺癌是引起人类死亡最常见的恶性肿瘤,其中80%为非小细胞肺癌(non small-cell lung cancer,NSCLC)。近年来,尽管局部晚期肺癌经过综合治疗,总体疗效有所提高,但到目前为止,肺癌患者的预后仍没有明显改善,即使能手术切除的Ⅰ～Ⅲa期肺癌患者,其五年生存率也仅在30%～40%之间,大多数患者死于肿瘤的复发与转移。研究表明,部分患者在治疗时已存在目前形态学不能诊断的转移,即微转移(micro-metastasis),这是导致治疗失败和患者死亡的主要原因。因此微转移的早期诊断不仅对肿瘤的复发和预后的判断有重要意义,而且能指导对患者的进一步治疗。目前的研究认为肿瘤远处侵袭转移的过程包括:肿瘤细胞从原发灶脱离,穿过基底膜细胞外基质,迁移到周围血管和淋巴管,到达远处器官后与内皮细胞粘附,侵出血管外,形成转移灶。由于一个细胞基因的表达变化能够精确的反映出其类型、发育阶段及功能状态,那么发生微转移的肿瘤细胞必定与原发灶和转移灶肿瘤细胞之间存在着部分基因的差异表达,因此找出其中对肿瘤微转移至关重要的基因不仅能够早期预测肿瘤的转移倾向,也有可能是未来治疗肿瘤药物的作用靶点。在前期实验中,我科陈芳琳博士利用序列基因表达技术(serial analysis of gene expression SAGE)比较了人巨细胞肺癌高转移株95D在原发灶和肺部转移灶之间的基因表达差异,共筛选出差异基因62个(表达差异3倍或3倍以上)。本实验利用GoSufer软件对上述基因进行GO(gene ontology)分析并筛选出可能与肿瘤转移相关基因,并利用稳定表达GFP (Green fluorescent protein)的人巨细胞肺癌高转移株95D裸鼠自发转移模型及Real-time PCR技术比较上述基因在肿瘤原发灶、外周血和肝转移灶细胞中的差异表达,弄清肿瘤转移过程中基因表达谱的连续性变化,并与前期实验结果进行比较,找出两次实验结果的异同,有望阐明有微转移倾向癌细胞特定的基因表达模式,为肺癌微转移提供可靠的预警依据。方法:1.将稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的人巨细胞肺癌细胞株95D/GFP接种于裸鼠右前肢皮下,建立肺癌裸鼠自发转移模型。2.根据前期实验结果并利用GoSufer软件进行GO(gene ontology)分析,筛选出可能与肿瘤转移相关的基因。3.用流式细胞分选术(fluorescence-activated cell sorting,FACS)分别纯化原发灶、外周血和肝转移灶中的肿瘤细胞,利用Real-time PCR技术检测肿瘤转移相关的基因在上述肿瘤细胞中的相对表达量。结果:1.裸鼠前肢皮下注射95D/GFP2周后均成瘤,成瘤率100%。其中3只未生存至2月,发生肝转移4只,肺部微转移1只,淋巴结微转移3只。活体荧光成像可观察到清晰的原发灶荧光成像及血管生长情况,裸鼠大体解剖后可见肝转移灶肿瘤细胞的GFP表达,普通切片可见肺及淋巴结的微转移。2.利用GoSufer软件筛选出CD9、RHOA、MYL12A、B2M、PTOV1、HSPA1B基因用于下一步实验。前期实验中CD9、RHOA、MYL12A、B2M在肺转移灶中高表达,而PTOV1、HSPA1B在肺转移灶中不表达。? ?3. CD9、RHOA、MYL12A基因在循环血肿瘤细胞(circulating tumor cells CTCs)中表达较少,其次是肝转移灶,在皮下原发灶中表达较多;B2M基因在皮下原发灶、循环血肿瘤细胞和肝转移灶中依次降低;PTOV1基因在CTCs中高表达,其次是皮下原发灶,肝转移灶中表达最少;HSPA1B基因只在原发灶中表达。结论:1. 95D/GFP细胞可在BALB/C裸鼠前肢皮下成瘤,并自发转移至肝脏、肺及淋巴结,成功构建人巨细胞肺癌自发转移模型。2.利用流式细胞分选术(FACS)分别收集原发灶、外周血和肝转移灶中的肿瘤细胞2×10~6、3963、5×10~5个。说明FACS收集外周血肿瘤细胞的是完全可行的,为研究肿瘤基因的更为完整的时空表达谱变化提供了实验基础。?3.CD9、RHOA、MYL12A、B2M、HSPA1B基因可能是潜在的肺癌转移抑制基因,而PTOV1可能促进肺癌经血循环微转移。