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肝癌作为最常见的恶性肿瘤之一,具有预后差、复发率高、转移性高等特点。脂类物质作为细胞的结构成分和能量代谢的主要储能物质,在细胞的生长增殖过程中发挥不可或缺的作用。代谢重编程是恶性肿瘤常见的生物特征,肝脏作为脂代谢的主要器官,脂代谢的改变对肝癌的发生发展具有重要影响。现有研究表明:与正常组织相比较,肝癌中脂肪酸和胆固醇合成明显增加,说明肝癌中脂类代谢途径从正常细胞的平衡状态发生了改变,因此可以作为抗肝癌治疗的有效靶点。芹菜素作为天然植物黄酮类物质,因自身内在毒性较低,且对癌细胞和正常细胞具有不同的效果等优势越来越受到研究人员的关注。目前就芹菜素的抗癌活性发现芹菜素能通过调控肿瘤细胞周期、诱导癌细胞凋亡和自噬、抑制癌细胞的侵袭和转移能力,而对肿瘤的代谢研究较少。表观遗传修饰在肿瘤的发生和发展中也具有不可或缺的作用。表观遗传修饰能导致相关基因的沉默或者过表达,进而对肿瘤的增殖、凋亡、自噬、转移等方面有重要作用。研究者通过研究天然药物与表观遗传之间的关系,发现芹菜素能够调控表观遗传相关酶类进而影响肿瘤的发生与发展。组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1A(Histone lysine-specific demethylase 1A,KDM1A)作为第一个被发现的组蛋白去甲基化酶,定位于细胞核,是一段由3个区域共852个氨基酸构成的多肽,其催化机制是将氢化物从甲基化的赖氨酸转移到FAD辅助因子开始,生成不稳定的亚胺中间体,水解后释放甲醛。研究表明KDM1A可以调控肿瘤细胞的代谢过程,进而满足肿瘤恶性增殖等一系列特征。本研究主要开展了以下研究:利用芹菜素处理肝癌细胞系(MHCC-97H、HepG-2),检测芹菜素对肝癌细胞的生物学特征的影响;通过转录组分析芹菜素影响肝癌细胞增殖的分子机制,特别关注其对肝癌细胞脂代谢途径的影响,并筛选出影响较大的表观遗传因子KDM1A;通过组蛋白赖氨酸去甲基化酶抑制剂ORY-1001处理肝癌以及干涉KDM1A构建干涉KDM1A细胞系,检测了下调KDM1A后对肝癌细胞增殖能力、凋亡情况以及肝癌细胞脂代谢途径的影响,以期阐明芹菜素对肝癌细胞的抑制作用的机制。通过研究,我们得到如下结果:1.芹菜素对肝癌细胞的生物学特征的影响使用不同浓度的芹菜素处理肝癌细胞,通过MTT及BrdU实验检测芹菜素对肝癌细胞增殖能力的影响,结果显示芹菜素抑制了肝癌细胞的增殖;并通过流式细胞仪进行凋亡分析,表明芹菜素能够诱导细胞凋亡,Western blot(WB)实验也证明了芹菜素能够增加活性凋亡蛋白的表达水平,降低非活性凋亡蛋白的表达水平。作者通过Transwell实验和划痕实验检测芹菜素对肝癌细胞侵袭、转移能力的影响情况,实验显示芹菜素能够显著降低肝癌细胞的侵袭、转移能力并利用软琼脂实验检测芹菜素对肝癌细胞体外成瘤能力的影响,其结果表明芹菜素能显著降低肝癌细胞的克隆形成能力。2.芹菜素调控肝癌细胞的脂质代谢通过对芹菜素处理的HepG-2的表达谱芯片进行分析,发现脂代谢相关通路与对照组相比显著下降。为了进一步验证芹菜素对肝癌细胞脂代谢的影响,作者利用RT-qPCR实验以及WB实验检测了脂质代谢相关酶类的mRNA和蛋白水平。RT-qPCR实验结果表明:芹菜素浓度为100μM可显著抑制MHCC-97H的SREBP1、SREBP2、HMGCR、SQLE、FSAN的mRNA的表达水平。芹菜素显著抑制HepG-2的SREBP1、SREBP2、FASN、HMGCR、HMGCS1、SQLE的mRNA表达,且具有浓度依赖效应。WB实验结果表明:MHCC-97H在芹菜素浓度为50μM时,相应的蛋白FASN、SQLE、HMGCS1、HMGCR的表达水平变化没有统计学上意义,当处理浓度为100μM时,相应蛋白的表达水平显著下降。由于脂代谢通路的降低会引起细胞体内脂类物质的减少,作者通过油红染色实验检测了芹菜素处理后肝癌细胞体内脂质变化情况。结果表明,芹菜素会造成肝癌细胞内脂质含量减少,且芹菜素浓度越高,减少程度越明显。3.芹菜素通过下调KDM1A调控肝癌细胞脂质代谢通过对数据库进行分析,作者发现KDM1A的表达量与肝癌患者预后呈负相关、与进程及恶性程度呈正相关;且KDM1A在临床肝癌患者中的表达量高于正常人中的表达量。为了研究芹菜素调控肝癌细胞脂质代谢的分子机制,作者通过RT-qPCR及WB实验检测了芹菜素处理肝癌细胞后,其KDM1A的表达变化情况,结果表明:芹菜素能够显著下调肝癌细胞中KDM1A的mRNA水平及蛋白水平;为了验证KDM1A在其中的作用,作者利用KDM1A抑制剂ORY-1001处理肝癌细胞以及构建了干涉KDM1A的肝癌细胞系。通过MTT及BrdU实验检测下调KDM1A后肝癌细胞的增殖能力,实验结果显示下调KDM1A后显著地抑制了肝癌细胞的增殖;并用细胞流式术检测了下调KDM1A后细胞的凋亡情况,实验结果表明下调KDM1A后诱导了细胞的凋亡。为了检测干涉KDM1A后脂质代谢的变化情况,作者通过RT-qPCR及WB实验检测了脂质代谢通路的变化情况,实验结果表明:干涉KDM1A后能够显著抑制脂质代谢途径中关键酶如SREBP1、SREBP2、FASN、HMGCR、HMGCS1、SQLE的mRNA及蛋白水平表达;为了进一步明确芹菜素与KDM1A的关系,作者构建了KDM1A过表达载体,对肝癌细胞进行KDM1A过表达后加芹菜素处理。结果表明KDM1A过表达能在一定程度上抵抗由芹菜素引起的增殖抑制及代谢通路的下调。综上所述,芹菜素可以通过靶向KDM1A调控肝癌细胞的脂质代谢,进而抑制肝癌细胞的增殖及生长。