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罗非鱼是我国及世界上重要的淡水养殖鱼类之一,在国民经济中具有重要地位。然而近年来链球菌病的暴发严重威胁着其养殖产业的健康发展,并造成了巨大的经济损失,因此探讨罗非鱼的抗病免疫机制具有重要意义。模式识别受体(Pattern recognition receptors,PRRs)对病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)的识别,是启动先天免疫反应的关键一步。Toll样受体(TLRs)是第一个被发现的模式识别受体基因家族,TLRs的激活及其介导的信号通路一直以来都得到研究者们的广泛关注。本研究从尼罗罗非鱼TLR信号通路着手,对参与其中的白细胞介素1受体相关激酶(Interleukin-1 receptor associated kinases,IRAKs)和肿瘤坏死因子受体相关因子(Tumor necrosis factor receptor associated factor,TRAFs)家族成员(IRAK1、IRAK4和TRAF3、TRAF4、TRAF6)进行克隆、表达特征及功能分析,为上述五个基因的免疫调控及罗非鱼抗感染免疫机制提供基础资料。取得主要研究结果如下:1.尼罗罗非鱼IRAK1和IRAK4基因的克隆及表达分析本研究克隆获得了尼罗罗非鱼IRAK1和IRAK4基因,并对其进行了表达特征分析。尼罗罗非鱼IRAK1基因(GenBank accession no.MK431853)的DNA序列包含15个外显子和14个内含子,cDNA序列为3495 bp,编码748个氨基酸。IRAK4基因(GenBank accession no.MK431854)的DNA序列包含10个外显子和9个内含子,cDNA序列为3025 bp,编码449个氨基酸。SMART分析显示,IRAK1和IRAK4均包括1个死亡结构域(DD)和1个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域(STKc)。氨基酸序列同源性分析显示,尼罗罗非鱼IRAK1与斑马宫丽鱼(Maylandia zebra)IRAK1的相似性最高(94%),而尼罗罗非鱼IRAK4与伯氏朴丽鱼(Haplochromis burtoni)IRAK4的相似性最高,达到96%。qRT-PCR结果表明,IRAK1和IRAK4在检测的所有组织中均有表达,血液中的表达量最高,并且在胚胎不同发育阶段均有表达。人工感染无乳链球菌后,IRAK1和IRAK4在尼罗罗非鱼五个组织(肠、鳃、脾、肾和血液)中的表达量出现了显著上调。使用LPS、Poly I:C、无乳链球菌WC1535和△CPS(荚膜多糖缺失株WC1535)处理体外尼罗罗非鱼巨噬细胞,可以诱导IRAK1和IRAK4基因的表达上调。以上研究表明,IRAK1和IRAK4基因在尼罗罗非鱼抗病原体免疫机制中发挥重要作用。2.尼罗罗非鱼TRAF3、TRAF4和TRAF6基因的克隆及表达分析本研究从尼罗罗非鱼中分离得到TRAF3、TRAF4和TRAF6基因,并对其表达特征进行了分析。尼罗罗非鱼TRAF3基因(GenBank accession no.MK227432)的DNA序列包含14个外显子和13个内含子,cDNA序列为2506 bp,编码591个氨基酸。TRAF4基因的DNA序列包含7个外显子和6个内含子,cDNA序列(GenBank No.MH986338)为4483 bp,编码470个氨基酸。TRAF6基因(GenBank accession no.MK227433)的DNA序列全长包含8个外显子和7个内含子,cDNA序列为3191 bp,编码571个氨基酸。SMART分析显示,TRAF3和TRAF6蛋白均含有1个环指、2个锌指、1个卷曲螺旋和1个MATH结构域,TRAF4蛋白含有1个环指、3个锌指、和1个MATH结构域。序列同源性分析显示,尼罗罗非鱼TRAF3、TRAF4和TRAF6分别与其他物种中的对应氨基酸序列具有较高的相似性,均与斑马宫丽鱼的相似性最高(98%、99%和98%)。尼罗罗非鱼TRAF3、TRAF4和TRAF6基因在检测的11个组织中均有表达,其中TRAF3和TRAF6基因在血液中的表达量最高,肝中的表达量最低,而TRAF4基因在脑中的表达量最高,脾和血液中的表达量最低。上述三个基因在胚胎不同发育阶段均有表达。人工感染无乳链球菌可以诱导TRAF3、TRAF4和TRAF6基因在尼罗罗非鱼各组织中的上调表达。体外尼罗罗非鱼巨噬细胞中,TRAF3和TRAF6的表达受到LPS、Poly I:C和WC1535显著诱导,对△CPS处理无应答。以上研究表明,TRAF3、TRAF4和TRAF6基因在尼罗罗非鱼抗病原体免疫机制中发挥重要作用。3.尼罗罗非鱼IRAK1、IRAK4和TRAF3、TRAF4、TRAF6基因的功能分析为研究IRAK1、IRAK4、TRAF3、TRAF4和TRAF6基因的功能及其在信号通路中的作用,本研究构建了上述基因的真核表达载体,转染293T细胞,进行双荧光素酶报告分析、亚细胞定位和免疫共沉淀实验。结果表明,pcDNA3.1-IRAK1、pcDNA3.1-IRAK4、pcDNA3.1-TRAF3、pcDNA3.1-TRAF4和pcDNA3.1-TRAF6均可在293T细胞中成功表达,并且过表达可显著增强NF-κB活性。共转染Myd88和IRAK1可显著上调Myd88介导的NF-κB活性,而共转染Myd88和IRAK4对Myd88介导的NF-κB活性无影响。亚细胞定位发现,IRAK1、IRAK4、TRAF3、TRAF4和TRAF6在293T细胞中均定位于细胞质。此外,IRAK1与IRAK4和TRAF6均存在相互作用。以上研究为阐明罗非鱼免疫调控机制提供了基础资料。