背景与目的：病理性血管生成是肿瘤生长和转移的关键环节之一，因而阻断或抑制新生血管的生成是抗肿瘤治疗的有效策略。同时病理性血管生成也见于糖尿病视网膜病变、动脉粥样硬化、慢性风湿性关节炎等多种疾病。近年来人们对血管的生成机制进行了广泛深入地研究，已证明血管的生成受多种相关因子的调节，相继发现了多种血管生成因子和血管生成抑制因子。以血管生成为靶点治疗肿瘤已成为肿瘤治疗研究的热点，有多种血管生成抑制剂相继进入临床试验阶段。 人纤溶酶原Kringle 5(简称K5)是新近发现的一种血管生成抑制因子，它是人纤溶酶原中的第五个饼环区(即Kringle环)，约有80多个氨基酸残基，分子量约为14 kDa，其中Kringle环含有严格保守的3个二硫键。它能作用于增生的血管内皮细胞，抑制细胞的增殖、迁移，并能诱导细胞凋亡，是最强的内源性血管增生抑制剂之一。但K5的具体作用机制目前还不明确。在研究K5作用机制的同时，通过改造它的结构以提高其活性成为另一研究热点。近来，有学者通过基因工程方法除去了K5环两边的氨基酸臂，保留了三个完整的二硫键，获得了一个突变的K5(即liteK5)。这种K5突变体在动物实验中表现出更高的活性，其抑制血管内皮细胞增生的能力约为野生型K5的两倍。 整合素是细胞膜受体，它通过与相应配体结合介导细胞与细胞外基质、细胞与细胞之间的黏附。RGD(Arg-Glv-Asp)序列作为整合素和其配体相互作用的识别位点，广泛存在于生物体内，其中细胞外基质中的黏附蛋白是人体中最常见的含RGD序列的蛋白。在肿瘤组织活化的内皮细胞及肿瘤细胞表面，整合素α<,v>β<,3>呈现上调状态。带有RGD序列的多肽不仅能够特异性结合肿瘤部位的内皮细胞，而且可以和肿瘤细胞产生特异结合，这为针对肿瘤的治疗性药物的递送提供了一个良好的途径。近年来，学者们探讨了多种含RGD序列短肽的功效，其中的RGDS短肽与整合素α<,v>β<,3>有良好的结合能力，并能显著抑制肿瘤生长。又有研究发现Ploy(RGD)可优先黏附细胞表面RGD依赖的整合素。因此，将K5与含RGD序列短肽融合，可协同它们的抗肿瘤作用。 方法 以人纤溶酶原K5 cDNA为模板，通过PCR得到：RGDRGD．1iteK5和RGDS-liteK5基因，将上述基因分别克隆到质粒pGEX1-λT和pGEX-4T-1中，构建重组原核融合表达载体pGEX-RGDRGD-liteK5和pGEX-RGDS-liteK5。在IPTG诱导的条件下，观察融合蛋白在大肠杆菌Rosetta中的表达情况。利用亲合层析柱对表达产物纯化，Western blot分析鉴定表达产物。 结果 PCR改造所获得的RGDRGD-liteK5和RGDS-liteK5基因长度分别为274和268 bp。通过酶切、测序等方法鉴定RGDRGD-liteK5和RGDS-liteK5基因正确克隆至原核表达质粒pGEX-1λT和pGEX-4T-1中。重组质粒pGEX-RGDRGD-liteK5和pGEX-RGDS-liteK5在大肠杆菌Rosetta中成功地表达出了GST/RGDRGD-liteK5和GST/RGDS-liteK5融合蛋白，并通过免疫学测定，分子质量约为36 kDa，与理论值相符。获得的融合蛋白经凝血酶切割后，得到了分子量约为10 kDa的RGDRGD-liteK5和RGDS-liteK5蛋白。 结论 本实验成功地改造了人纤溶酶原Kringle 5基因，构建了重组质粒pGEX-RGDRGD-liteK5和pGEX-RGDS-liteK5，并通过基因工程的方法得到了RGDRGD-liteK5和RGDS-liteK5蛋白，为进一步研究其生物学功能奠定了基础，为探索构建多靶点抗肿瘤基因工程药物做出了积极的尝试。