海参(Sea cucumber,holothurians)是一种具有重要经济、营养价值并具有潜在药用价值的生物活性物质的海洋经济动物。但是海参在其运输、贮藏、加工等过程中会发生“自溶”现象,甚至经过热加工的即食海参同样也会出现体壁劣化的“失稳”现象,即低温冷藏过程中海参体壁仍会出现变软、融化等失稳现象。目前国内外对海参体壁“失稳”的研究是以鲜活海参为研究对象,以蒸煮过的海参体壁为实验材料的相关研究尚未见文献报道。本文分别以鲜活海参体壁和蒸煮海参体壁为实验材料,通过对比两者所得浸提酶液中蛋白质组成并追踪其体壁降解酶学性质,以探索其体壁失稳机理;通过对酶的抑制以探索其体壁稳定化机理。首先,以鲜活海参为实验材料通过高速匀浆、浸提、盐析、透析等初步分离步骤并辅以高通量分析,不仅获得最佳酶提取条件,更获得以海参多糖、海参胶原蛋白及其它多糖为底物的多糖水解酶系。结论如下:第一,建立简便、灵敏、可高通量分析的多糖水解酶活力测定体系,即,以微孔板微量震荡仪作为酶反应体系、酶标仪作为测定体系,以MBTH法测定多糖水解酶的酶解产物,从而获得对多种底物(海参多糖、海参胶原蛋白、α-淀粉、果胶、聚半乳糖醛酸、羧甲基纤维素、壳聚糖、海带多糖等)具有水解活性的酶;第二,通过不同p H浸提条件下提取的粗酶液分别以淀粉、CMC-Na、果胶、聚半乳糖醛酸、海参多糖、海参胶原蛋白为底物进行筛选,从而找到作用于某一底物时的最佳浸提p H,结果选择以p H7.0浸提条件下得到的海参体壁粗酶液同时能够降解海参多糖和海参胶原蛋白,并且也具有水解果胶、聚半乳糖醛酸等多糖的活性;第三,热稳定性实验结果表明在p H7.0时,粗酶在100℃保温20min后,其活力增高尤以水解海参多糖、壳聚糖衍生物及果胶的活力为最分别高达对照组的3、3、4.6倍,水解聚半乳糖醛酸、胶原蛋白和CMC-Na的酶活力也达到了1.8、1.5、1.4倍,这体现粗酶中各种多糖水解酶较强的热激活现象,由于海参多糖和胶原蛋白的化学结构并未全部解析,只能说明这些结构中可能含有淀粉和/或果胶的α-1,4糖苷键和纤维素的β-1,4糖苷键,更重要的是,说明该酶系为强热激活抗逆酶,且与海参体壁劣变有关;第四,采用Q-Fast Flow阴离子交换层析梯度洗脱分离海参体壁粗酶,并选择0.1、0.2、0.3、0.4、1.0、2.0mol/L Na Cl为梯度洗脱的浓度梯度,共洗脱出6个蛋白峰,其中0.2M、0.3M Na Cl洗脱峰(分别为F1和F2级分)体现较高比活力,因此,这两级分洗脱酶液通过脱盐、浓缩后进行凝胶层析(Sephacryl S-300和S-200),得到分子量在250k Da以上的蛋白条带。将F1级分经过90℃和100℃加热处理20min后,仍有活力,分子量几乎未变,主要集中在250k Da以上。其次,以蒸煮海参为实验材料通过高速匀浆、浸提、盐析、透析等初步分离步骤并辅以高通量分析,不仅获得最佳酶提取条件,更获得以海参多糖、海参胶原蛋白及其它多糖为底物的多糖水解酶系。结果发现:第一,通过不同p H浸提条件下提取的粗酶液分别以淀粉、海带多糖、果胶、聚半乳糖醛酸、海参多糖、海参胶原蛋白为底物进行筛选,通过浸提p H优化实验发现,在p H7.0浸提条件下所得粗酶对海参多糖和胶原蛋白具有较高的水解活力,并探究了在低于60℃的条件下,该酶便可以降解海参多糖和胶原蛋白,这证明了失稳现象与海参体壁中海参多糖和胶原蛋白降解有关。第二,在70℃保温20min后仍具有较大降解胶原蛋白的活力,说明胶原蛋白降解酶是一种高温酶;第三,粗酶在p H3.0-13.0条件下保存4hr后,胶原蛋白降解酶活力变化不大,果胶酶、聚半乳糖醛酸酶、淀粉酶和海参多糖降解酶活力总体来说是升高的,这说明一定的离子强度和p H条件对这些酶具有激活作用,对胶原蛋白降解酶影响较小。第四,采用Q-Fast Flow阴离子交换层析后梯度洗脱酶液浓缩后测多糖水解酶活力,并未发现明显活力,进而将离子交换柱未吸附酶液浓缩后进行凝胶层析,峰蛋白经测定活力发现具有蛋白酶活力、以及降解海参多糖降解酶和胶原蛋白的酶活力。最后,本章探究了金属离子对蒸煮海参体壁粗酶稳定化的影响,结果发现Mg2+、Fe3+和壳聚糖对海参多糖降解酶具有激活作用,相对活性分别达到了对照组的199%、256%、421%,同样的,K+、Ca2+、Zn2+、Ba2+、Cu2+、Mn2+、Fe3+、尿素、壳聚糖对海参胶原蛋白降解酶具有激活作用;除Mg2+、Fe3+和壳聚糖的其余金属离子、EGTA和EDTA对海参多糖降解酶具有抑制作用,而EGTA对胶原蛋白降解酶具有抑制作用,这为探究海参体壁稳定化提供了实验依据。