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毒死蜱(Chlorpyrifos,CPF)作为一种在环境中广泛使用的有机磷农药,具有确定的胚胎神经发育毒性。脑多巴胺能神经系统对有机磷农药暴露敏感,并关联多种认知情感异常疾病,目前关于其在胚胎脑组织细胞中的研究还少有报道。本课题于胚胎早期暴露毒死蜱,探讨其对多巴胺能神经元相关脑区域神经细胞的影响,并进一步利用计算机三维重构技术,研究对区域整体形态的影响,从宏观与微观层次上检测毒死蜱的毒理效应。一、胚胎期暴露毒死蜱对纹状体、腹侧被盖区、黑质区神经细胞的影响:在胚胎E7.5-11.5天暴露0,5mg/kg CPF,制备E14、E16、E18定时胚胎,通过定位脑组织切片和Nissl染色,对纹状体、腹侧被盖区、黒质区计数神经细胞数量,进行统计分析,研究结果发现:(1)纹状体区:纹状体区观测到神经元呈现圆形、椭圆形,具有胞体,在胞体中央有大而圆的胞核,胶质细胞表现为颗粒状,形态呈现扁平、三角形、星形状;毒死蜱处理后,细胞整体形态上并无显著性改变,但细胞密度与正常组相比,略微松散。毒死蜱处理后E14神经元减少12.78±0.5%,胶质细胞减少31.93±3.0%;E16神经元减少11.09±1.6%,胶质细胞减少26.98±1.2%;E18神经元减少11.0±0.5%,胶质细胞减少22.02±1.7%。(2)腹侧被盖区:腹侧被盖区可以观测到神经元的胞体、突起,甚至可以观察到树突;胶质细胞展现圆形、梭形状。毒死蜱处理后,与正常组相比,细胞在整体上无明显变化。毒死蜱处理后E14胶质细胞减少34.25±2.9%;E16胶质细胞减少27.92±4.0%;E18胶质细胞减少12.0±1.1%,但神经元无统计学差异。(3)黒质区:黒质区神经元展现为椭圆形或锥形状,突起较为明显,胞核染色较淡;胶质细胞具有突起,但不具备树突与轴突,形态呈现梭形、圆形。毒死蜱处理后,细胞整体形态上无明显性差异,但细胞密度与正常组相比,排列略微松散。毒死蜱处理后E14神经元减少9±1.4%,胶质细胞减少36.47±4.5%;E16神经元减少10.09±1.7%,胶质细胞减少32.79±3.0%;E18神经元减少7.29±0.6%,胶质细胞减少23.52±3.4%。总体来看,胚胎期暴露毒死蜱对细胞形态无明显影响,但明显减少纹状体、腹侧被盖区、黒质区三个区域的胶质细胞数量,减少纹状体、黒质区的神经元数量而对腹侧被盖区的神经元数量无明显影响,在两类细胞中,毒死蜱对胶质细胞的影响强于对神经元的影响。二、毒死蜱对胚胎脑多巴胺能神经元的影响:采用TH免疫荧光染色方法,进一步研究胚胎期暴露毒死蜱对相关脑区多巴胺能神经元的影响,研究结果发现:1)腹侧被盖区:腹侧被盖区分布大量的多巴胺能神元,排列成不规则分布,多巴胺能神经元呈现椭圆形,胞体大小展现为中等。毒死蜱处理后,多巴胺能神经元形态无明显性变化。毒死蜱处理后DAPI标记细胞减少9.50±0.8%,但多巴胺能神经元数量及TH/DAPI没有统计学差异。2)黒质区:黒质区多巴胺能神经元密度集中,排列散乱,神经元成锥体状。毒死蜱处理后,神经元整体形态上无显著性变化,但排列与正常组相比,略微散乱。毒死蜱处理后DAPI标记的细胞减少14.24±1.5%,多巴胺能神经元减少11.51±0.5%,TH/DAPI没有统计学差异。总体来看,胚胎期暴露毒死蜱对腹侧被盖区和黑质区DAPI标记细胞均有明显抑制作用,对多巴胺能神经元也有一定的抑制作用,但不改变TH/DAPI比值,这说明毒死蜱对多巴胺能神经元的抑制作用是非选择性的。三、毒死蜱对胚胎脑纹状体三维形态的影响:对E16纹状体区域的连续切片进行显微拍照,经Photoshop CC、Image Pro Plus配准调整,3D Doctor三维重构,构建出纹状体三维立体结构,分析相关数值。研究结果发现,E16纹状体Control组体积为0.43 mm3,CPF组为0.42 mm3;Control组表面积为13.43 mm~2,CPF组为9.40 mm~2。综合上述结果,我们发现胚胎期暴露毒死蜱,对神经细胞微观层次具有显著性的影响;但在宏观形态上,毒死蜱对区域整体结构影响很小。