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玉米赤霉烯酮(ZEA)是饲料中常见的霉菌毒素之一,具有类雌激素、生殖毒性、遗传毒性和免疫毒性等作用。虎杖苷(PD)是中药虎杖的主要活性成分,具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤活性等作用。泌乳奶牛的乳腺上皮细胞对于牛奶质量起着重要作用。ZEA对奶牛乳腺上皮细胞是否有损伤效果,PD能否缓解ZEA对奶牛乳腺上皮细胞的损伤不得而知。因此,研究ZEA对奶牛乳腺上皮细胞的损伤及PD的缓解机制,为饲料业对ZEA毒性的缓解奠定理论基础。本试验以奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)为研究对象设计体外试验,筛选适宜浓度ZEA处理MAC-T细胞,对活性氧(ROS)、线粒体膜电位、内质网(ER)应激及细胞凋亡进行检测,探讨PD缓解ZEA诱导的MAC-T细胞作用及机制。首先确定ZEA对MAC-T细胞生长的影响。利用不同浓度ZEA(0、7.5、15、30、60、90、120和240μM)处理MAC-T细胞24h,检测细胞活力和乳酸脱氢酶(LDH)的变化。结果表明,与对照组相比,随着ZEA浓度的升高,MAC-T细胞活力呈现显著或极显著抑制(P<0.01或P<0.001)。结果说明ZEA对MAC-T细胞有毒性作用,30μM及以上浓度达到极显著差异,选择添加30μM ZEA进行后续研究。通过检测ROS水平和线粒体膜电位变化的结果表明,与对照组相比,ZEA处理组的ROS极显著升高,线粒体膜电位显著降低。进一步研究ZEA损伤MAC-T细胞的机制。用30μM ZEA处理MAC-T细胞24h,检测ER应激相关基因葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、转录激活因子6(ATF6)、转录激活因子4(ATF4)、细胞凋亡信号调节激酶1(ASK1)和C/EBP的同源蛋白(CHOP)mRNA表达水平。利用Hoechst33342和AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况,检测Caspase-3的活性水平及B细胞淋巴瘤-2基因(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(BAX)的表达变化。结果表明,与对照组相比,ZEA组GRP78、ATF6、ATF4、ASK1和CHOP基因的mRNA表达均上调;细胞凋亡率和BAX基因表达显著升高(P<0.01);Caspase-3活性显著增加(P<0.01);Bcl-2基因表达下调(P<0.001)。结果说明ZEA能诱导MAC-T细胞凋亡。最后本研究使用PD来缓解ZEA对MAC-T细胞损伤。根据ZEA对MAC-T细胞的损伤效果,从饲料添加剂的角度寻找缓解方法。用5、10和20μM PD处理MAC-T细胞24h检测细胞活力。结果表明,与对照组相比,5、10和20μM PD对细胞活力差异不显著。PD与30μM ZEA进行组合细胞活力测定,结果表明5μM PD对细胞活力恢复效果明显,因此选择5μM PD进行后续研究。PD对ZEA诱导MAC-T细胞氧化损伤、ER应激和细胞凋亡的检测。结果表明,与ZEA组相比,PD+ZEA组的丙二醛(MDA)显著下降(P<0.05),谷胱甘肽(GSH)和超氧化物歧化酶(T-SOD)升高(P<0.01);GRP78、ATF6、ATF4和CHOP基因的mRNA表达均下调;细胞凋亡率和BAX基因表达显著降低(P<0.01);基因Bcl-2表达上调(P<0.05)。综上所述,本研究结果表明ZEA诱导MAC-T细胞损伤,引起ER应激,发生细胞凋亡。PD通过降低ER应激和细胞凋亡具有缓解ZEA对MAC-T细胞损伤的作用。