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旋毛虫病是由旋毛形线虫引起的一种呈全球性分布的人兽共患食源性寄生虫病,可感染人及150多种动物,通过生食或半生食感染旋毛虫的肉品而感染,严重时可导致死亡。旋毛虫的生活史包括三个主要阶段:新生幼虫、肌幼虫和成虫,成虫阶段又分为雌虫和雄虫。蛋白质组学是近年来快速发展的新型学科,它能够提供关于蛋白表达的定量信息以及翻译后蛋白修饰和蛋白定位的信息,定量蛋白质组学中的非标记定量技术(Label-freequantification)以其耗费低、对样品操作少、高通量和高精确度得到了人们越来越多的重视。本试验首次应用Label-free定量技术对旋毛虫新生幼虫、肌幼虫、雌性和雄性成虫的蛋白质组进行了定量分析和比较,鉴定到了期特异性和性别特异性蛋白,并对新生幼虫和肌幼虫间的显著差异表达蛋白果糖-1,6-二磷酸酶进行了克隆和原核表达,获得了重组蛋白,检测了其抗原性和酶活性。1.旋毛虫肌幼虫与新生幼虫的比较蛋白质组学研究应用蛋白质组学方法中的Label-free技术比较分析了旋毛虫肌幼虫与新生幼虫的虫体全蛋白。共鉴定到1936个蛋白质,其中差异性表达蛋白1180个。差异性表达蛋白包括期特异性蛋白质395个(肌幼虫期特异性蛋白291个,新生幼虫期特异性蛋白104个);丰度上有显著差异的蛋白质785个(ratio>2.0或ratio<0.5,且Pvalue<0.05),其中差异倍数>10的蛋白196个,差异倍数.>100的蛋白22个。对1180个显著性差异表达蛋白进行生物信息学分析,在Gene Ontology(GO)分析中共1003条蛋白序列被4931条GO功能条目注释;KEGG通路注释中,共提取到与574个差异蛋白序列相关的444条KEGG信号/代谢通路。2.旋毛虫雄性与雌性成虫的比较蛋白质组学研究应用Label-free定量比较蛋白质组学方法比较分析了旋毛虫雌性成虫与雄性成虫的虫体全蛋白。共鉴定到1877个蛋白质,其中差异性表达蛋白279个。差异性表达蛋白包括性别特异性蛋白92个(雌虫特异性蛋白55个,雄虫特异性蛋白37个);丰度上有显著差异的蛋白187个(ratio>2.0或ratio<0.5,且P value<0.05,其中差异倍数>10的蛋白5个)。对279个显著性差异表达蛋白进行生物信息学分析,GO分析发现139条蛋白序列被540条GO功能条目注释;KEGG通路注释中,共提取到与68个差异蛋白序列相关的101条KEGG信号/代谢通路。3.旋毛虫果糖-1,6-二磷酸酶基因的克隆表达及生物学特性分析根据GenBank上公布的旋毛虫果糖-1,6-二磷酸酶(fructose-1,6-bisphosphatase,FBP)基因序列,设计一对特异性引物,以旋毛虫总RNA为模板,用RT-PCR技术扩增出一条约为1Kb的DNA片段。测序结果表明该片段包含FBP的完整ORF,长1,026 bp,编码341个氨基酸。BLAST分析发现其核酸和氨基酸序列与已知旋毛虫FBP的基因和氨基酸序列的相似性分别为99%和100%。将该ORF亚克隆到pET-32a(+)载体中,酶切鉴定正确后转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析,结果表明该融合蛋白大小为55.4kDa,重组蛋白主要以包涵体的形式表达。Western blot结果显示该重组蛋白能被旋毛虫感染小鼠血清识别。对纯化、复性的重组蛋白进行了酶活性测定,结果发现该重组酶的最适pH为7.0,最适温度为37℃。