膝骨关节炎是以膝关节疼痛、肿胀、僵硬、关节活动受限为主要临床表现的一种不可逆性的退行性骨关节疾病。目前针对膝骨关节炎初、早期的临床研究与临床诊疗仍存在诸多问题,在临床研究方面,缺乏针对KOA的X级分级为Ⅰ～Ⅱ级且分期为初期或早期的高质量的药物干预性随机对照临床试验;在临床诊疗方面,无法确定运动疗法可以使哪些KOA群体长期获益,物理疗法因缺乏统一的操作标准而疗效不能得到保障,西药以改善临床症状为主且具有不同类型的毒副作用。藏药如意珍宝丸具有1000多年的历史,属于藏医药经典名方的范畴,属于国家医保乙类品种,其对于KOA能起到干黄水和疏通筋络的作用,能预防和治疗因“木布”向内扩散与向外扩散而引起的“夏真”（肉痹）、“锐真”（骨痹）、“杂真”（脉痹）、“曲真”（筋痹）的治疗特点。本研究通过多中心、随机、双盲、安慰剂、平行对照临床研究评价如意珍宝丸对初期、早期KOA的临床疗效,填补民族医药经典名方治疗KOA高质量循证证据的不足,并进一步通过mRNA转录组学探索如意珍宝丸对初期、早期KOA的“多成分-多靶点-多通路”的生物学机制,为民族医药经典名方的现代化传承与发展提供示范研究。研究目的本研究旨在通过前瞻性的多中心、随机、双盲、安慰剂、平行对照研究,评价藏药经典名方如意珍宝丸治疗初、早期KOA的临床疗效。此外,通过mRNA转录组学进一步探索如意珍宝丸通过调控相关的基因及其所对应的相关信号通路、生物学过程,阐述其效应机制。研究方法1.藏药经典名方如意珍宝丸治疗膝骨关节炎的多中心、随机、双盲、安慰剂、平行对照临床试验:本研究在2021年10月13日-2021年12月25日期间于中国中医科学院望京医院、北京中医药大学第三附属医院、中国中医科学院西苑医院、西南医科大学附属中医医院、首都医科大学附属北京中医医院、上海中医药大学附属曙光医院、广东省中医院等15个分中心,共纳入240例符合纳排标准的膝骨关节炎受试者,随机分为试验组与对照组,每组各120例。试验组受试者的干预措施为如意珍宝丸+健康宣教,对照组受试者的干预措施为如意珍宝丸安慰剂+健康宣教。两组受试者的干预周期均为4周,结束干预后随访4周,总的试验周期为8周。主要结局指标为VAS疼痛评分的应答率,次要结局指标为WOMAC总积分、WOMAC子项目积分（关节疼痛、关节僵硬、关节功能）、生活质量简明版（SF-12）评分、中医证候评分。分别在2周后、4周后、6周后、8周后对受试者进行访视并进行疗效评价,并且在患者接受干预期间对试验药物进行安全性评价。缺失数据的处理采用末次测量数据结转的方式进行插补,在混杂因素的处理方面采用纵向数据边际模型进行混杂因素的控制并进行临床疗效的评价,研究结果按照随机对照试验的CONSORT规范进行报告。2.基于mRNA-Seq高通量测序技术的如意珍宝丸治疗膝骨关节炎的效应机制研究:实验所用血样均来自于临床试验部分取自于试验组、安慰剂组KOA受试者干预前、干预4周后的全血,RNA血样全部用PAXgeneBloodRNATube采血管进行采集,每支采血管的标准采血量为2.5mL,血样采集完毕后,立即将其放入-80℃冰箱冻存,以备检测。本研究血样的选取按照干预前后VAS评分改善值从大到小的排序进行选取。经过严格的筛选,实验组选取如意珍宝丸组VAS评分改善值最大的前17例受试者基线与4周后的RNA全血,对照组血样选取安慰剂组10例VAS评分改善值为0的受试者基线与4周后的RNA血样。治疗前后的血样共计54个血样。本研究通过总RNA的提取、总RNA的样品检测、文库的构建及上机测序、测序数据过滤、参考基因组比对、基因表达量分析、差异表达基因的层次聚类分析、差异表达基因的GO富集分析、差异表达基因Pathway分析等过程,分别筛选如组、安慰剂组干预前、干预后对KOA受试者产生的差异表达基因,并筛选出如意珍宝丸组相对于安慰剂组的差异表达基因,利用GO与KEGG Pathway富集分析差异表达基因所调控的与KOA相关的信号通路与生物学过程,进一步探索如意珍宝丸治疗KOA的疗效机制。研究结果1.如意珍宝丸治疗膝骨关节炎的多中心、随机、双盲、安慰剂、平行对照、临床试验:（1）共纳入240例符合纳排标准并签署知情同意的受试者。第2周访视时,有1例受试者因不符合纳排标准因为误纳被剔除,有2例受试者失访（无用药记录与疗效评价记录）;第4周访视时,有4例失访（无第3-4周的用药记录与疗效评价记录）。最终全数据集纳入分析237例,其中试验组120例,对照组117例;（2）在基线方面,两组受试者的年龄、收缩压存在不均衡的情况,P值均＜0.05;（3）在疗效评价方面,临时备用止痛药属于混杂因素,考虑到混杂因素及有效性结局指标的基线测量值对结局指标存在影响,故将这些因素及其与时间的交互作用纳入纵向数据边际模型中,以消除治疗方法之外的其余混杂因素对结果的影响;边际模型由三部分组成,分别对各个测量时点响应变量的条件期望、条件方差以及给定协变量后,重复观测之间的相关结构作出假设。其中前两部分除了没有假设响应变量的分布形式外,与广义线性模型是完全相同的。模型第三部分通过对个体重复观测间相关形式的定义,反映了来自同一个体的观测之间存在相关的特性。由此将广义线性模型推广成为适用于纵向数据的情况。（4）在主分析组方面,如意珍宝丸治疗膝骨关节炎改善WOMAC总分方面,边际模型结果显示,group×time变量的系数P值为0.0265＜0.05,两组WOMAC总分随时间变化有显著性差异,表现为试验组相对于对照组的优势会随着时间的增加而越大。如意珍宝丸治疗膝骨关节炎改善WOMAC疼痛评分方面,边际模型结果显示,group×time变量的系数P值为0.0305＜0.05,两组WOMAC疼痛评分随时间的变化有显著性差异,表现为试验组相对于对照组的优势会随着时间的增加而越大。如意珍宝丸治疗膝骨关节炎改善VAS评分应答率方面,边际模型结果显示,两组的变化均无显著性差异,但是试验组相对于对照组的应答率优势比约在4周及8周之间大于1,说明在这期间试验组VAS评分的应答率优势优于对照组的应答率优势,且两组受试者的VAS评分应答率优势比在6周达到峰值。如意珍宝丸治疗膝骨关节炎改善WOMAC功能评分、WOMAC僵硬评分、SF12-PCS（生活质量-躯体健康）评分、SF12-PCS（生活质量-躯体健康）评分、中医证候评分方面,边际模型结果显示,两组的变化均无显著性差异。（5）在VAS评分应答率的亚组分析方面,对于基线VAS评分为(4,5]的受试者,系数group×time的P值为0.0166＜0.05,系数group×time2的P值为0.0466＜0.05,表示两组有显著性差异,在2-8周期间,试验组应答率始终高于对照组,且两组应答率的差异先增大后减小,在大概4.5周时,两组应答率差异达到最大。交互分析方面,基线VAS评分为[3,4]分、年龄段为[50,55]岁的受试者,试验组VAS评分的应答率优于对照组;基线VAS评分为(4,5]的受试者,试验组VAS评分应答率也在一定程度上呈现优势,尤其是对于年龄较大的受试者来说,试验组的优势更加明显。（6）在WOMAC功能评分的亚组分析方面,年龄段在[50,55]岁的受试者,系数group×time的P值为0.0428＜0.05,系数group×time2的P值为0.0267＜0.05,两组有显著性差异,表示试验组WOMAC功能总分降幅始终高于对照组,降幅之差呈二次曲线变化,在大概4.5周时,两组降幅之差达到最大;年龄段在[61,65]岁时,系数group×time的P值为0.0221＜0.05,两组有显著性差异,表示试验组WOMAC功能评分相较于对照组下降的幅度更大;WOMAC功能评分基线大于20分时,系数group×time的P值为0.031＜0.05,两组有显著性差异,表示试验组WOMAC功能评分相较于对照组下降的幅度更大。交互分析方面,对于年龄较小的患者,试验组在降低WOMAC功能评分方面更有优势,对于年龄较大的患者,试验组在降低病情较重患者WOMAC功能评分方面更有优势。（7）在中医证候评分的亚组分析方面,年龄段在[56,60]岁的受试者,系数group×time的P值为0.0439＜0.05,系数有显著性差异,表现为试验组中医证候总分的降幅优于对照组;年龄段在[61,65]岁的受试者,系数group×time的P值为0.0219＜0.05,系数group×time2的P值为0.0071＜0.05,两者均有显著性差异,表示试验组中医证候总分的降幅优于对照组,试验组中医证候总分的降幅大概在6.5周后会超过对照组;基线中医证候总分大于4分的受试者,系数group×time的P值为0.0296＜0.05,两组有显著性差异,试验组中医证候总分的降幅优于对照组。交互分析显示,对于基线中医证候总分大于4分的受试者,试验组在年龄段为[50,55]和年龄段为[65,70]的受试者中中医证候总分的降幅较对照组快;对于基线中医证候总分大于4分的受试者,在年龄段为[56,60]和[61,65]的受试者中,试验组中医证候总分的降幅逐渐随着时间的变化优于对照组。2.基于mRNA-Seq高通量测序技术的如意珍宝丸治疗膝骨关节炎的效应机制研究:（1）54个样本的质量检测结果均为A类,表示所有的样本质量均满足建库测序要求,目前成功率约为96.18%;（2）本研究使用DNBSEQ平台一共测了 54个样品,每个样品平均产出6.23G数据,测序的原始数据包含低质量、接头污染以及未知碱基N含量过高的 reads,过滤后 readsClean Reads Q20（%）均大于等于 93.75%,Clean Reads Q30（%）均大于等于87.62%,样品间的数据量比较稳定,无较大差别,总体测序质量较好,可进行后续分析;（3）GO富集分析结果显示,①在软骨细胞的生长发育与凋亡方面,如意珍宝丸可能通过4个基因RPL26、RPL31、RPL34、RPL36A参与到SRP依赖性共翻译靶向膜蛋白的调控机制、1个基因（RPL26）参与到p53类介导物对内源性凋亡信号通路的正调控、2个基因（COMMD3-BMI1、H2AC19）参与到染色质沉默的调控、1个基因（ATP5MF-PTCD1）参与到tRNA 3’-末端加工、1个基因（COMMD3-BMI1）参与H2A-K119泛素化组蛋白等生物学过程进行调控;②在延缓KOA骨重塑和骨赘等的形成进程方面,如意珍宝丸可能通过1个基因（MCAM）参与血管损伤愈合、5个基因（CCBE1、FGF2、CXCL8、RLN1、TEK）参与到正调控血管生成、3个基因（CCBE1、TEK、ATOH8）参与到内皮细胞迁移的正调控;③在修复关节周围肌肉损伤及萎缩方面,如意珍宝丸可能通过2个基因（NEBL、DMD）参与到肌纤维的发育调控;④在神经保护方面,如意珍宝丸可能通过调控2个基因（PALM、SHANK1）参与到突触的形成;（4）KEGG Pathway富集分析显示,①在软骨细胞的生长发育方面,如意珍宝丸可能通过4个基因（RPL26、RPL31、RPL34、RPL36A）参与基因信息过程中的翻译过程、4个基因（RPL26、RPL34、RPS4Y1、RPS27）参与到了核糖体进行调控;②在调控氮的代谢方面,如意珍宝丸可能通过2个基因（CA6、CA8）参与到氮的代谢调控氮的代谢进而调控NO的浓度,从而抑制其对软骨细胞的破坏作用以及非感染性炎症的发生;③在神经的保护方面,如意珍宝丸可能通过2个基因（ABO、A4GALT）参与到鞘糖脂生物合成acto和neolacto系列调控GSLs来促进神经细胞的生长、增殖、分化;④在改善炎症方面,如意珍宝丸可能通过3个基因（HLA-DRB5、CXCL8、TEK）参与到与类风湿性关节炎相关的炎症、免疫等机制对KOA起到改善症状与延缓病程的作用。研究结论1.藏药经典名方如意珍宝丸对KOA初、早期轻型患者,在改善VAS评分应答率、WOMAC总分、WOMAC疼痛评分、WOMAC功能评分、中医证候评分方面具有较好的临床疗效,尤其是在改善KOA患者WOMAC总分、WOMAC疼痛评分方面具有明显的优势。可以填补藏药经典名方如意珍宝丸治疗KOA循证证据的不足,为民族医药经典名方的传承与发展做出了示范研究。2.如意珍宝丸治疗膝骨关节炎,可能主要通过调控RPL26、RPL31、RPL34、RPL36A、RPS4Y1、RPS27、COMMD3-BMI1、H2AC19、ATP5MF-PTCD1、COMMD3-BMI1关键基因的差异表达,参与软骨细胞的生长发育与凋亡方面;可能通过调控 MCAM、CCBE1、FGF2、CXCL8、RLN1、TEKCCBE1、TEK、ATOH8 关键基因的差异表达,来延缓KOA骨重塑和骨赘等的形成进程;可能通过调控NEBL、DMD关键基因的差异表达,参与修复关节周围肌肉损伤及萎缩;可能通过调控PALM、SHANK1、ABO、A4GALT关键基因的差异表达,参与神经的保护;可能通过调控CA6、CA8关键基因的差异表达,参与氮的代谢;可能通过调控HLA-DRB5、CXCL8、TEK关键基因的差异表达,参与到与类风湿性关节炎相关的炎症、免疫等机制。创新点1.本研究以随机对照试验为基础,首次在中医药临床疗效评价方面运用边际模型对纵向数据及混杂因素进行控制和统计分析,证实了如意珍宝丸对初、早期KOA的临床治疗能起到较好的治疗作用,填补了藏药经典名方如意珍宝丸治疗KOA循证证据的不足。2.本研究通过mRNA转录组学研究发现,如意珍宝丸治疗KOA可能主要通过调控RPL26、RPL31、RPL34、RPL36A、RPS4Y1、RPS27、COMMD3-BMI1、H2AC19、ATP5MF-PTCD1等关键基因参与到软骨细胞的生长发育与凋亡、骨重塑和骨赘的形成、关节周围肌肉损伤及萎缩、神经的保护、氮的代谢、炎症、免疫等方面,初步阐述了藏药经典名方如意珍宝丸治疗KOA初期、早期的相关“靶点-通路”及生物学过程,为如意珍宝丸的临床定位提供了客观的生物学依据。