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每年柑橘病毒病害都会对世界柑橘生产造成严重的经济损失。由柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus, CTV)引起的柑橘衰退病和由柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus, CYVCV)引起的柑橘黄化脉明病是目前危害柑橘的两种重要病毒病害。为了掌握这两种病毒病在我国的发生流行规律,进而建立科学防控体系,急需建立对两种病毒的快速、有效的检测方法。而血清学检测方法操作简单、特异性好、灵敏度高,且适合大规模样品检测,因此被广泛应用于植物病毒的诊断、流行规律分析、抗病育种和科学防控等方面。为此,本论文分别制备了CTV和CYVCV的特异、灵敏的单克隆抗体,并以其为核心分别建立了检测这两种病毒的特异、灵敏的血清学方法,从而为这两种病毒病的诊断、流行病学分析和科学防控体系建立提供物质和技术支撑。(1)CTV单抗的制备及其检测应用：CTV重庆分离物的外壳蛋白基因(CP)用原核表达载体pET-28a在大肠杆菌进行表达,表达的重组蛋白通过Ni2+-NTA胶纯化后作为抗原免疫BALB/c小鼠,经细胞融合、筛选和克隆获得4株分泌抗CTV单抗的杂交瘤细胞株系(14B10、14H11、20D5和20G12)。间接ELISA方法测得4株单抗腹水的效价在10-6-10-7之间,Western blot分析显示,4株单抗均能与CTV的CP发生特异性的免疫反应。以单抗为核心建立检测CTV的dot-ELISA、Tissue blot-ELISA、TAS-ELISA三种检测CTV的血清学方法,其中dot-ELISA和TAS-ELISA可以检测感染CTV病叶粗提液的灵敏度分别达到1：2560和1：10240倍稀释(w/v, g/ml)。此外,利用制备的单抗研制出了检测CTV的胶体金免疫试纸条,其检测病叶的灵敏度达到1：1280倍稀释,从而实现CTV检测的田头化、快速化、傻瓜化。TAS-ELISA检测灵敏度最高,可以很好地应用于脱毒树苗的检测。田间调查显示,CTV在我国重庆市、江西省和浙江省柑橘产区发生普遍,且血清学方法的检测结果与RT-PCR检测结果的符合率达到99.5%以上。CTV单抗的制备及其灵敏、特异的血清学检测方法的建立对我国CTV的检测和防控具有重大作用。(2) CYVCV单抗的制备及其检测应用：为了诊断、流行病学分析和控制CYVCV病害,本论文以原核表达的CYVCV外壳蛋白作为抗原免疫小鼠和兔子,分别制备了4株抗CYVCV的特异、灵敏的单抗和兔多抗。4株单抗腹水的间接ELISA效价在10-6-10-7之间,单抗均能特异性地与CYVCV CP蛋白和CYVCV感染的柑橘叶片粗提液反应。以单抗为核心建立检测CYVCV的dot-ELISA、Tissue blot-ELISA、DAS-ELISA、TAS-ELISA四种血清学方法,其中dot-ELISA、DAS-ELISA和TAS-ELISA检测CYVCV病叶的灵敏度分别达到1：2560、1：10240和1：20480倍稀释(w/v, g/ml)。用建立的血清学方法分析了来自我国重庆市、云南省果园125份疑似病毒病样品,检测结果发现,其中46个样品感染CYVCV,发病率达到36.8%,然而在浙江和江西省158个样品中未检测到该病毒,且血清学方法的检测结果与RT-PCR检测结果的符合率达到99.6%以上。这四种血清学方法对我国CYVCV的诊断和检测、流行病学调查、脱毒苗的生产和防控具有重要意义。