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促性腺激素调节的睾丸RNA解旋酶(GRTH/DDX25),在睾丸中特异表达,存在于间质细胞与生殖细胞中(减数分裂期的精母细胞和圆形精子细胞),由雄激素在不同发育阶段调节其转录和翻译水平。GRTH基因敲除雄性小鼠不育,其精子形成过程被完全阻断在第8/9步骤,导致圆形精子细胞无法变长,造成无精子症。而且,GRTH基因敲除雄性小鼠的圆形精子细胞中的拟染色质小体形状显著变小,结构浓缩。现有的研究证据表明,小分子干扰RNA(siRNA)和microRNA(miRNA)的调控通路路径存在于拟染色质小体中,其中包括加工siRNA和miRNA前体到成熟小分子的Dicer酶,RNA诱导的沉默复合体(RISC)和另一种生殖细胞RNA解旋酶MVH。GRTH基因敲除雄性小鼠中许多基因的蛋白产物缺失,但其mRNA表达水平未见异常,表明GRTH可能参与这些基因表达的转录后调控。为阐明雄性生殖细胞中miRNAs与GRTH调节的相关通路,我们利用高通量miRNAs基因芯片检测GRTH基因敲除与野生型雄性小鼠睾丸中纯化的圆形精子细胞miRNAs表达谱,并通过实时荧光定量RT-qPCR验证芯片结果。在GRTH基因敲除的圆形精子细胞中,共有119个miRNAs表达水平与野生型小鼠相比显著升高,其中包括普遍表达的let-7家族,睾丸倾向表达的miR-470与miR-34c,睾丸特异表达的miR-469。利用NIH3T3细胞系进行体外研究上调miRNAs的靶基因表明,miR-469可以抑制包含过渡蛋白2(TP2)与鱼精蛋白2(Prm2)编码区与3′-UTR的荧光素酶重组质粒中表达的荧光素酶活性。与经典的miRNA调节区域所在的靶基因的3′-UTR不同,TP2与Prm2 mRNA片段缺失与突变分析表明miR-469的种子区域与TP2编码区(376-382nt)以及Prm2编码区(271-277; 292-298nt)完全互补,并形成稳定的二级结构。进一步分析表明,miR-469不降解TP2与Prm2 mRNA,而是通过抑制其翻译而调节TP2与Prm2的蛋白表达水平。由于TP2与Prm2均是圆形精子变长过程中染色质重构的重要蛋白,而GRTH基因敲除小鼠中miR-469表达水平上升,可能是TP2与Prm2蛋白在GRTH敲除小鼠中缺失的主要原因。而且,在GRTH基因敲除小鼠的圆形精子细胞中,由于拟染色质小体形态与结构显著异常,上调的miRNAs对靶基因的调控通路路径因此可能发生在细胞质中,而不是先前提出的位于拟染色质小体中。GRTH基因敲除小鼠的纯化圆形精子细胞中,miRNAs初级前体转录本(pri-miRNAs)与野生型小鼠相比显著升高,其中包括pri-let-7d,pri-let-7g, pri-miR-34c, pri-miR -469以及pri-miR -470。Drosha与DGCR8是miRNA微处理复合物主要成员,可以加工pri-miRNAs产生miRNAs前体(pre-miRNAs),GRTH基因敲除小鼠的纯化圆形精子细胞中,Drosha与DGCR8基因的mRNA与蛋白表达水平与野生型小鼠相比均显著升高。因此,GRTH在睾丸精子细胞miRNA的生物生成发挥着重要的负调控作用,以维持精子发生过程中成熟miRNA分子的动态平衡,从而使精原细胞能够顺利发育至成熟精子。GRTH对精子细胞miRNA生物合成的抑制作用的发现,也为这种解旋酶在雄性生殖细胞发育过程中所发挥的调控机制提供了新的见解。