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尼古丁作为一种有毒的危险废弃物,给人们的生存环境带来了极大威胁,从烟草废弃物中去除尼古丁或者将其转化为有价值的化合物显得尤为重要,而微生物处理方法因其快速、价廉等优点被普遍关注。研究微生物降解尼古丁的机理可为揭示尼古丁代谢的生物化学机制和进一步的实际应用提供理论依据和参考。本论文从杭州农药厂的活性污泥中筛选到一株新型高效降解尼古丁的菌株Shinellasp.HZN7,并对其生理生化特性进行了研究,结果显示:菌株HZN7在30～35 ℃时降解效率最高;在pH值6.5～8.0之间降解速率变化不大。在温度为30 ℃,pH为7.0的条件下,Shinella sp.HZN7能在3小时内将浓度为500mg/L的尼古丁完全降解。然后研究了该菌株的代谢中间产物,利用紫外光谱仪(UV)、高效液相色谱仪(HPLC)和高效液相色谱-质谱联用仪(LC-MS)共检测到五种代谢中间产物,分别为6-羟基尼古丁(6-hydroxy-nicotine,6HN),6-羟基麦斯明(6-hydroxy-N-methylmyosmine,6HMM),6-羟基假氧尼古丁(6-hydroxypseudooxynicotine,6HPON),6-羟基-3-琥拍酸吡啶6-hydroxy-3-succinoyl-pyridine,HSP)和 2,5-二羟基吡啶(2,5-dihydroxypyridine,2,5-DHP),初步推测菌株 HZN7 降解尼古丁的途径为吡啶和吡咯烷交叉途径。进一步利用生物分子学方法对上述降解途径进行验证,我们通过转座子突变和影印平板的方法构建了尼古丁降解失活突变株文库,筛选到323株突变株。从中筛选出3株具代表性突变株N7-W18、N7-X5和N7-M17进行研究,它们在降解过程中分别负责积累中间产物6HN、6HPON和HSP,验证了上述五种代谢产物,并明确了菌株HZN7的降解途径为吡啶和吡咯烷交叉途径。最后我们试图获得关键降解基因:利用SEFA-PCR法扩增突变株N7-X5的突变序列克隆出orf2基因,该基因不论碱基序列还是氨基酸序列和任何定义的基因都没有同源性。通过对orf2的敲除和功能互补,验证了orf 是菌株HZN7将6HPON转化成HSP所必须的基因,但不是功能基因,只起间接影响。