研究背景及意义:新甲型 H1N1 大流行流感病毒(2009 pandemic H1N1 virus,pdm/09)于2009年在人群中暴发流行,之后该病毒进入猪群,成为猪流感病毒基因池中的成员之一而备受关注。经该病毒溯源研究得知,pdm/09是由人流感、禽流感和猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)重配形成的病毒,在人群流行后,它的基因片段已进入猪流感病毒中,并开始产生新的变异毒株。这表明pdm/09在人间流行后,返传给猪,获得与SIV重组形成新的重配病毒的能力,可能拥有形成新的重配毒株,并引起流感大流行的潜能。因此,重组有pdm/09片段的新现SIV对人类的潜在威胁,必须得到关注。流感病毒跨种属感染具有特殊性,非编码微小RNA(microRNA,简称miRNA)是其中一个非常重要的影响因素,细胞miRNA对流感病毒的影响,体现在病毒与宿主细胞相互作用过程中(简称相互作用),细胞miRNA可以直接促进病毒的复制,或者通过阻止宿主被激活的抗病毒机制而协助感染的发生,或者通过调节细胞miRNA自身表达来促进宿主细胞对病毒感染的抵抗或者限制病毒的增殖过程。重组有pdm/09片段的新现SIV对传代人肺腺癌A549细胞的跨种属感染,是否存在某些特殊细胞miRNA,以及相关的miRNA-mRNA-蛋白质的交联网络又是如何,至今还缺乏相关研究。高通量测序和生物信息学分析是目前研究miRNA相对成熟的方法,先前也有一些研究借助这两种方法,对未知或者已知的miRNA的功能进行深度挖掘,但在病毒感染过程中,感染宿主参与的基因与研究所使用的宿主细胞种类、病毒毒株(型、亚型)的不同以及检测的方法有关,从而导致所得到的结果归纳性不佳,这尚需更多的研究进行多方面探索,以丰富miRNA与流感病毒的相互作用关系。综上,本文关注miRNA在流感病毒感染过程中发挥的作用,主要侧重在具有跨种属感染潜力的新现SIV感染A549细胞过程中是否存在特殊miRNA这一问题上,我们利用高通量深度测序和生物信息学大量数据分析,绘制新现SIV感染过程中miRNA-mRNA-蛋白质相互作用图谱,寻找特异性差异表达的miRNA,探讨其对病毒复制的影响,进一步研究微小RNA在开发抗病毒药物、研制疫苗和筛选新的生物标记物的潜力。目的:1.探讨新现SIV-SW2 783(简称SW2783)与参考流感病毒毒株是否具有不同的复制能力和跨种属感染潜能。2.探讨新现SW2783感染A549细胞后是否存在特殊差异表达的miRNA及具有靶向关系的mRNA。3.探讨新现SW2783感染A549细胞后是否存在特殊差异表达的蛋白质.以及与筛选出的miRNA的相互作用关系。4.初步探讨筛选的miRNA对新现SW2783的复制的影响。方法:1.建立新现SW2783及两株参考毒株(经典SIV-SW3861-简称SW3861和pdm/09的疫苗株CA09-简称CA09)体内和体外感染实验模型,对比三株流感病毒感染性的差异,通过血凝素实验(HA)、半数组织细胞感染实验(TCID50)、蚀斑实验、免疫组化和免疫荧光等实验,绘制病毒复制动力曲线,了解其不同的致病性特征。2.利用miRNA芯片技术和转录组高通量测序技术,检测SW2783、SW3861和CA09三株流感病毒(后两种病毒作为对照病毒)感染人肺腺癌A549细胞24小时后(急性感染期)的差异表达miRNA和mRNA,并对它们进行联合分析,最终得到SW2783感染A549细胞中特殊差异表达的miRNA-mRNA靶向关系对。3.通过蛋白质测序iTRAQ技术,进一步研究SW2783感染A549细胞后特异性差异表达的蛋白质,结合miRNA筛选结果,对miRNA和蛋白质进行交联分析,绘制miRNA-蛋白质关系图谱,在蛋白质水平上再次验证和探讨与跨种属感染人A549细胞过程相关的特殊miRNA。4.筛选得到的miRNA通过在A549细胞中的miRNA敲除和过表达技术,确定其对潜在靶基因的影响,并通过病毒拯救实验验证该miRNA对三株流感病毒复制的影响,进一步研究miRNA是否对SW2783的感染具有特殊的调控作用。结果:1.成功建立三株流感病毒的体外感染组织和细胞模型,显示不同病毒对组织细胞不同的感染能力。新现SW2783能够在体外感染A549细胞和人肺组织,并显示出较好的复制增殖能力,提示其具有跨种属感染人的潜力;经典猪流感病毒SW3861则体现出相对较弱的感染能力,提示其跨种属感染人的可能性较低;09年大流行甲型流感病毒CA09则能有效感染人细胞和组织;通过小鼠感染体内实验分析病毒致病特征发现,三株流感病毒均能感染小鼠,引起相应病理反应,并能够在小鼠肺部进行有效增殖,但SW2783的感染能力稍强其他两株流感病毒。2.通过对三株流感病毒感染A549细胞后24h的总RNA进行miRNA芯片检测和转录组mRNA高通量测序,得到与未感染对照组(NC组)比较差异表达的细胞miRNA和mRNA,经韦恩图分析,共筛选出52个特异性差异表达的细胞miRNA和2543个与之相关的mRNA,它们可能与跨种属感染A549细胞有关,利用GO和KEGG分析其功能,绘制出miRNA-mRNA相互作用图谱。用荧光定量PCR检测miRNA和mRNA表达量和相对倍数,发现三个 miRNA(hsa-miR-140-5p,hsa-miR-30a-3p 和 hsa-miR-582-5p)和五个相关的mRNA所对应的基因(RCC1,ERVFRD-1,RANBP1,SCARB2和RPS29)可能与SW2783跨种属感染A549细胞有密切关系。3.用iTRAQ蛋白质测序技术,对三株流感病毒A549细胞感染24h后表达的蛋白质进行差异表达分析,共得到128个差异表达的蛋白质,推测可能与跨种属感染有关,其中70个差异表达蛋白质与52个候选miRNA存在靶向关系。通过与 hsa-miR-140-5p,hsa-miR-30a-3p 和 hsa-miR-582-5p 建立相互作用网络,进行功能分析和筛选,6个候选蛋白质符合要求。用Western blot进行验证和通过表达量变化相对倍数分析后发现,RPS29,HMGA2,IFIT2和PPIA蛋白在SW2783感染A549细胞过程中呈特异性上调,我们推测这是新现SIV跨种属感染A549细胞时显著表达的功能性蛋白。4.综合对所有miRNA、mRNA及蛋白质的功能和与病毒之间的关系进行分析,我们发现非编码miRNA:hsa-miR-140-5p与3个潜在的靶蛋白(ERVFRD-1,PPIA和IFIT2)有关,值得进一步探讨它们之间的关系。通过敲除和过表达实验,确定了 hsa-miR-140-5p对ERVFRD-1,PPIA和IFIT2具有靶向调节作用。通过病毒拯救实验,我们尚发现hsa-miR-140-5p能够特异性影响SW2783病毒的感染,但对SW3861和CA09病毒的感染能力影响不大。因此,我们认为非编码miRNA—hsa-miR-140-5p可能作为潜在跨种属感染的流感病毒筛选的生物标记物或者新的药物靶点。结论:本研究用具有跨种属感染潜力的新现重配H3N2亚型SIV作为研究对象,围绕其跨种属感染过程中特异性差异表达的miRNA及相关miRNA-mRNA-蛋白质相互作用网络开展研究,获得如下发现:1.新现SW2783在体内外实验中均提示其具有跨种属感染的特征。2.通过miRNA-mRNA整合网络分析,筛选出3个非编码miRNA:hsa-miR-140-5p,hsa-miR-30a-3p 和 hsa-miR-582-5p,它们在 SW2783 感染过程中呈现特异性的差异表达,推测可能与跨种属感染有密切关系。3.通过miRNA-mRNA-蛋白质整合网络分析,筛选出非编码miRNA:hsa-miR-140-5p与3个潜在的靶蛋白(ERVFRD-1,PPIA和IFIT2)可能存在调控关系,并有可能对有跨种属感染的毒株在A549细胞中的感染能力有影响。4.通过功能实验证实hsa-miR-140-5p能够对SW2783感染A549细胞有特殊调控作用,表现在其能影响病毒的复制,并影响其靶向的ERVFRD-1,PPIA和IFIT2的表达。综上,在SW2783感染A549细胞过程中,非编码miRNA—hsa-miR-140-5p发挥了特殊的调控病毒复制作用,可能作为筛选跨种属感染的新型流感病毒的潜在生物标志物,或者治疗的新型药物靶点。